生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读8+非肿瘤免疫浸润+机器学习+动物验证，非肿瘤也可以这么做！非肿瘤生信

导语

今天给同学们分享一篇非肿瘤结合免疫的生信文章“Identification of diagnostic biomarkers and therapeutic targets in peripheral immune landscape from coronary artery disease”，这篇文章于2022年9月5日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。外周血生物标志物是监测冠状动脉疾病(CAD)进展的越来越重要的方法。然而，他们仍然很少被探索。研究旨在确定和验证差异表达的免疫相关基因(DE-IRG)在CAD中的诊断和治疗价值。结果发现，基于筛选出的14个DE-IRG构建了晚期CAD的诊断模型。作者验证了其中4个基因与CAD有很强的相关性，IL13RA1可能通过调控JAK1/STAT3通路参与动脉粥样硬化的炎症、纤维化和胆固醇外流过程。

1. 外周血中差异mRNA表达的鉴定

研究涉及199名CAD患者和218名对照者的外周血转录组。PCA分析显示，批次效应在三个基因组中被有效去除（图1A、B）。共鉴定出762个DEG，其中396个基因上调，366个基因下调（图1C）。上调前五位的基因是C17orf78、TTTY21、TMEM213、COL21A1和SNX31，而下调前五位的基因是EGR3、TTTY7、TMEM196、DNAJC28和OLR1。热图显示CAD患者和对照组之间|logFC|>0.2的基因，表明它们可能参与了CAD的病理过程（图1D）。

图1 DEG的鉴定

2. DEG的功能富集分析

为了探索这些DEG与调节过程中涉及的生物学功能之间的关系，作者构建了蛋白质互质作用网络(PPI)。PPI分析显示这些基因在蛋白质水平上有很强的联系（图2A）。GO分析揭示了分别涉及分子功能、生物过程和细胞成分的DEG的概况，例如受体-配体活性、转运蛋白复合物和细胞过程（图2B）。KEGG通路富集图显示，主要富集的通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用和IL-17信号通路，表明与炎症反应和神经活动相关的功能有很强的相关性（图2C）。

图2 筛选出的差异基因的功能富集分析

3. DE-IRGs测定和免疫相关细胞景观分析

CAD患者的上述DEGs与IRGs交集。确定了CAD患者的58个DE-IRG（图3A）。同时，发现这些7种免疫细胞亚群的比例与CAD组不同。其中，CAD中活化的树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、Th17细胞和MDSC的比例升高，而活化B细胞和CD56杀伤细胞的比例降低（图3B，C）。此外，变化的外周免疫细胞之间存在相关性（图3D），例如活化的CD4T细胞/Th2细胞，巨噬细胞/肥大细胞和中性粒细胞/浆细胞样树突状细胞。

图3 免疫相关基因和相应的免疫细胞亚群

4. CAD关键DE-IRGs的鉴定及免疫诊断模型的构建

作者通过LASSO回归进行降维，***终确定了14个基因来构建CAD的诊断模型（图4A、B）。通过ROC曲线评估已确定的14个关键外周DE-IRG的诊断性能。ROC曲线下面积分别为CCR9、CER1、CSF2、CXCL2、HTR3C、IL13RA1、INSL5、MBL2、MMP9、MSR1、NR4RA2。然而，当所有14个基因都包含在一个诊断模型中时，训练数据集和测试数据集中的AUC分别达到0.968和0.859（图4E，F）。结果证明，这些组合的DE-IRGs具有良好的诊断潜力，也可能成为CAD有希望的预防和治疗靶点。

图4 14基因诊断模型的建立与检验

5. CAD患者免疫特征分析

14个关键DE-IRG在CAD和对照组之间显示出显着变化。其中CCR9、CER1、CSF2、IL13RA1、INSL5、MBL2、MMP9、MSR1、NTS、TNFRSF19基因表达上调，CXCL2、HTR3C、IL1A、NR4A2基因表达下调(图5A)。这些基因显示出显着的正相关（图5B）。考虑到多种免疫成分在CAD诊断和病理机制中的重要作用，作者分析了CAD中免疫细胞与DE-IRGs表达之间的相互关系。例如，IL13RA1在中性粒细胞、3种树突状细胞、巨噬细胞、记忆B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、MDSC、自然杀伤细胞、肥大细胞、2种细胞中表现出强烈的上调表达T细胞和嗜酸性粒细胞，以及活化B细胞、活化CD8T细胞和CD56dim自然杀伤细胞的快速下调表达。MMP9在中性粒细胞、3种树突状细胞、单核细胞、记忆B细胞、巨噬细胞、γδT细胞、嗜酸性粒细胞中表达增加，在活化B细胞、活化B细胞中表达呈下降趋势CD8T、效应记忆CD4/CD8T细胞、未成熟B细胞（图5C）。

图5 冠心病患者外周血免疫特征

6. 在体内验证10个候选DE-IRG与CAD之间的相关性

第20周，小鼠主动脉弓病理染色显示大量脂质斑块聚集，导致管腔狭窄（图6A）。CAD模型组的平均体重比对照组急剧增加（图6B）。同时，CAD组外周循环低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TRIG）水平显着升高（图6C，D）。全血总mRNAs检测显示，CAD模型组CCR9、CSF2、IL13RA1、NTS表达量显着高于对照组（图6E-H、M）。IL1A在模型组中也有所升高，表现出与在线数据结果相反的趋势（图6I）。然而，两组之间在CXCL2、INSL5、MSR1、NR4A2和TNFRSF19方面没有差异图6G、J-L、N）。

图6 动物验证

7. IL13RA1激活JAK1/STAT3通路调控CAD中巨噬细胞功能

在体外，ox-LDL上调BMDMs中IL13RA1mRNA的表达，激活JAK1/STAT3信号通路并增加VEGF-C的产生（图7A、B–E）。在体内，类似地，在20周HFD饮食诱导的LDL-/-小鼠（CAD小鼠模型）的主动脉中，IL13RA1mRNA表达、磷酸盐-JAK1、磷酸盐-STAT3、VEGF-C和IL-6蛋白水平增加（图7C，D-F）。将siRNA转染RAW264.7细胞后（图7G），IL13RA1mRNA表达显着下调（图7H），导致JAK1和STAT3、VEGFC、TGF-β的磷酸化水平下调和α-SMA（图7I，J）。IL13RA1敲低组也降低了SCARB1和ox-LDL刺激的CD36mRNA水平（图7M，N）。有趣的是，IL13RA1的敲低增加了IL-6的产生（图7I，J）。在ox-LDL的刺激下，上述变化趋势一致且更加明显。IL13RA1敲低组巨噬细胞吸收的脂滴减少（图7K，L）。

图7 IL13RA1敲低对CAD相关因子表达的影响

总结

CCR9、CER1、CSF2、IL13RA1、INSL5、MBL2、MMP9、MSR1、NTS、TNFRSF19、CXCL2、HTR3C、IL1A和NR4A2是作者从数据集中筛选出的差异表达的CAD免疫相关基因。作者还分析了免疫细胞浸润。作者基于以上14个基因构建了一个具有良好效率的诊断模型。其中，CCR9、CSF2、IL13RA1和NTS被证实在HFD喂养的LDLR−/−小鼠中异常表达。作者专注于IL13RA1，发现它参与调节巨噬细胞中脂质的转运、炎症和纤维化，从而影响CAD。对非肿瘤相关感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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