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导语

今天给同学们分享一篇尤文氏肉瘤中一个新的泛素化相关基因UBE2T的鉴定和验证的生信文章“Identification and validation of a novel ubiquitination-related gene UBE2T in Ewing’s sarcoma”，这篇文章于2023年2月16日发表在Front Oncol期刊中，影响因子为5.738。尤文氏肉瘤(ES)是世界上***常见的恶性骨肿瘤之一。然而，ES的基因和信号通路的分子机制仍未得到充分理解。为了确定参与ES发生和进展的候选基因，研究使用生物信息学方法筛选了与ES相关的关键基因和生物学通路。

图1 研究流程图

1. ES中DEG的识别及功能富集分析

在对微阵列结果进行标准化后，发现了DEG（GSE45544中有595个，GSE17618中有3343个）。根据维恩图，两个数据集的重叠部分包括187个基因（图2A）。在尤文肉瘤组织和非癌组织的比较中，有56个下调基因和131个上调基因。根据对KEGG通路的分析，DEG在细胞周期和金黄色葡萄球菌感染中显着丰富（图2B）。根据GO分析，DEG中BP的改变主要集中在细胞分裂、细胞增殖、细胞粘附、有丝分裂核分裂、细胞凋亡的正调节过程和药物反应（图2C）。ATP结合、蛋白质结合、染色质结合和蛋白激酶结合在DEG的MF中得到了显着丰富（图2D）。DEGs的CC改变主要富集在纺锤体极、膜、细胞质、粘着斑、细胞质、核质、细胞外外泌体和细胞核中（图2E）。

图2 ES中DEG的识别及功能富集分析

2. PPI网络和模块的构建与分析

使用Cytoscape插件工具MCODE以建立DEG-PPI网络***有意义的模块。PPI网络（图3A）包括149个节点和1246条边，其中36个基因下调和113个基因上调，而MCODE网络（图3B）由43个节点和857条边组成。此外，通过ClueGO（图3C）可视化了MCODE-DEGs的生物过程分析，它集中于细胞周期蛋白依赖性蛋白的调节、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、胞质分裂、核染色体分离、有丝分裂中期/后期转变的调节,和主轴组织。此外，分层聚类发现，根据训练集的表达谱，***重要模块的基因表达水平显着区分了ES样本和非肿瘤样本（图3D）。

图3 PPI网络

3. Core-DEG选择与评估

前15个关键基因，包括CCNB2、CCT2、CD44、ECT2、FOXM1、HLA-DPA1、ITGA6、KIF20A、LYZ、MKI67、PLK1、RFC4、TGFBR2、TYMS和UBE2T，在Cytoscape插件构建了一个关键基因的交互网络，产生了15个节点和43个边（图4A）。然后，利用ClueGO软件研究关键基因的生物学过程，主要集中在有丝分裂胞质分裂、dTMP生物学过程和自身抗原耐受诱导的正调控；这些数据表明，关键基因在调节细胞周期和内部环境稳态方面具有重要作用（图4B）。此外，关键基因的突变生存分析是在cBioPortal中使用Kaplan-Meier方法在线完成的。在15个关键基因中，只有UBE2T的生存分析有和没有改变的对数秩检验表明具有统计学意义（P<0.05），UBE2T改变显示总体和无病生存率显着降低（图4C），并且有较差的结果。这些数据表明UBE2T可能是ES进展中的重要生物标志物。因此，UBE2T被定义为“core-DEG”，稍后将对其进行研究。

图4 核心基因的鉴定与评估

4. UBE2T和CD99在验证数据集和ES样本IHC中的表达变化

使用GSE68776验证了core-DEG的表达。火山图显示发现了15,440个DEG（上调=939，下调=6,435）。UBE2T在验证数据集中显着上调（图4D）。此外，IHC用于鉴定UBE2T蛋白在尤文氏肉瘤和正常组织中的表达。研究结果表明，UBE2T蛋白在ES中过表达，但在正常组织中未过表达（图4E）。各组之间存在统计学显着差异（图4F）。显然，研究数据支持了作者的预测。此外，CD99在ES组织的IHC中具有较高的特异性诊断价值，因此有必要观察ES样本与对照组之间的差异。IHC结果显示CD99在ES组织的细胞膜上呈弥漫性阳性（图4G、H）。

5. UBE2T在ES训练集和验证集的诊断性能

图5描述了UBE2T在ES中的诊断价值。与对照组相比，UBE2T在训练集（GES17618和GSE45544）的ES中显着过表达（图5A）。UBE2T诊断ES的ROC曲线下面积(AUC)为0.75，灵敏度和特异性分别为0.85和0.62（图5B、C）。有趣的是，核心基因在验证集（GSE68776）中对ES的诊断评价也很出色。UBE2T表达在ES中显着增加（图5D）。ROC的AUC为0.90，灵敏度为0.94，特异性为0.79（图5E、F）。显然，这些发现表明UBE2T对ES诊断具有极好的价值。

图5 UBE2T在ES训练集和验证集的诊断性能

6. 聚类分析

根据MCODE模块基因的表达水平，将55个带有患者的ES样本分为4个亚组：C1（N=17）、C3（N=12）、C4（N=13）)和C2(N=13)(图6A)。在k=2到k=10个簇中，K=2的一致性***，k=4次之（图6B）。UMAP分析表明集群之间存在显着差异（图6C）。此外，热图显示MCODE-DEG的表达模式在四个亚组之间存在差异（图6D）。Kaplan-Meier生存分析显示亚组之间存在显着差异（图6E），尤其是C3和C4，而C3的ES患者比C4患者的疾病发展更快。并且，C3中34个基因的表达水平与C4相比显着升高（图6F）。

图6 聚类分析

7. UBE2T高表达与ES患者预后不良的相关性分析

基于训练集，进行单因素Cox回归分析以研究核心DEGs在ES中的预后风险，结果表明UBE2T是一个独立的危险因素（图7A)。此外，KaplanMeier生存曲线证明了UBE2T表达与生存之间的联系。UBE2T高表达患者的总生存时间明显短于UBE2T低表达患者（图7B）。此外，C3中UBE2T明显高于C4（图7C），存活时间明显短于C4（图7D）。这些结果表明UBE2T表达的上调与ES患者的较差结果相关。此外，风险评分和生存时间研究显示，高风险评分组患者的生存时间明显低于低风险组（图7E）。研究结果表明，高风险评分组导致疾病快速进展。图7F描述了各种风险评分、生存事件和基因表达变化之间的关联。可以看出，当UBE2T表达上调（图7F）和风险评分增加（图7F）时，患者的存活率急剧下降（图7F）。正如预测的那样，UBE2T被视为一个风险独立因素，风险评分随着其表达的增加而增加。