8+单细胞生信发文思路：探讨肿瘤微环境的异质性和趋同性，创新性高，适合用于扩充研究方向！！

结直肠癌（CRC）约占人类所有恶性肿瘤的 10%，是全球第三大常见癌症，其死亡率（9.4%）在恶性肿瘤中排名第二，仅次于肺癌。截至 2020 年，全球有超过 93.5 万人死于 CRC 或其并发症。传统的手术结合放化疗的模式并没有达到理想的治愈效果。在此背景下，免疫疗法应运而生，并迅速成为包括 CRC 在内的多种肿瘤的主要治疗模式，并在少数患者中实现了长期、持续的缓解，但大多数患者在暂时的免疫反应后并没有实现肿瘤的长期控制。

本研究选取了 10 例未经治疗的 CRC 患者的肿瘤、副肿瘤和血液样本。根据 SingleR 软件包和 CellMarker 数据库的注释，作者***终确定了 8 种主要细胞类型，包括 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、髓样细胞、先天性淋巴细胞（ILCs）、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞（图 1A）。提取每种细胞类型并进一步分组注释，***终确定了 25 种细胞亚型（图 1B）。根据主要细胞类型的差异确定的前五个标记物以气泡图的形式显示出来（图 1E）。有趣的是，当作者追踪组织起源时，发现免疫细胞，尤其是 Tex、TAMs、树突状细胞（DCs）和成纤维细胞在肿瘤组织中高度富集（图 1C）。为了研究 TME 中的相互作用网络，作者使用 CellChat 计算了潜在的配体-受体对。为使相互作用可视化，作者进行了网络可视化（图 1D）。值得注意的是，Tex、巨噬细胞、TAMs 和 DCs 与其他细胞系的细胞之间的相互作用对数***多，揭示了它们在 TME 中的主导作用。

图1 来自 CRC 患者肿瘤、邻近肿瘤组织和外周血的单细胞概况

1. CD8+ T cells

CD8+ T细胞被分为九个亚群，并被注释为四种细胞类型：幼稚CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞（Tem）、效应CD8+ T细胞（Teff）和Tex（图2A）。为了明确每种细胞类型的功能，作者提取了标记基因，并将其载入 Metascape （图 2B, C ）。伪时间轨迹显示，CD8+ T 细胞变得衰竭（图 2D），抑制受体（IRS）的表达以阶梯方式增加。作者通过单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）分析对 CD8+ T 细胞周围的所有转录因子进行了聚类，并利用聚类算法将其分为九个模块（图 3E ）。值得注意的是，模块 1 转录因子包括核受体 ROR-gamma (RORC)、核受体亚家族 1 D 组成员 1 (NR1D1)、过氧化物酶体增殖激活受体 gamma (PPARG) 和甾醇调节元件结合蛋白 2 (SREBF2) 在 Tex 中被显著激活（图 3F）。

图3 CD8+ T 细胞的相互作用网络和转录调控网络

2. CD8+ T 细胞衰竭时效应器功能的丧失

Tex 效应器功能的丧失可分为三大类：（1）细胞表面 IRS 的上调；（2）抑制性可溶性因子和环境因子，如白细胞介素 10（IL10）、IL4、转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素α/β（IFNα/β）；（3）免疫抑制细胞（11）。作者研究了不同细胞类型中的免疫检查点。值得注意的是，IRS（包括抑制性受体 T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域 3（TIM3）、淋巴细胞活化基因 3 蛋白（LAG3）、程序性细胞死亡蛋白 1（PDCD1）、TIGIT、CD27、细胞毒性 T 淋巴细胞蛋白 4（CTLA-4）和肿瘤坏死因子受体超家族成员 9（TNFRSF9））在 Tex 中上调。富集分析表明，Teff 富集于许多促炎通路，如 IL-2、-3、-17 和 -18 信号通路，而 Tex 则富集于 IL-4 和 -10 免疫抑制通路以及 PD-1 信号通路（图 2B、C）。GSVA 分析证实了这些结果（图 2G）。同时，伪时间分析显示，与 IRS 相关的基因随着分化而显著上调，如 PD-1 和 CTLA-4。免疫抑制相关基因如 IL4、IL1RN 和 IL4I1 的表达增强，而免疫激活相关基因如 IL18BP 和 IL5RA 的表达降低。这一发现与之前的研究结果一致，即 T 细胞衰竭通常表现为效应功能的逐步丧失。为了进一步确定 Tex 与 TME 中其他细胞之间的相互作用，作者进行了 CellChat 分析。首先，作者分析了Tex表达的免疫抑制受体，包括TIGIT、CTLA-4、ICOS和PDCD1，发现不同细胞产生不同的配体-受体模式（图3A）。内皮细胞和肿瘤细胞主要分泌脊髓灰质炎病毒受体（PVR）和NECTIN2，它们作用于Tex表面的TIGIT受体。DC和TAM分泌的CD80和CD86与CTLA-4相互作用。调节性 T 细胞（Tregs）主要分泌 CD274，作用于 PDCD1。此外，对 PD-L1 通路调控网络的分析表明，Tregs 是 PD-L1 的主要发送者，而 Tex 则是主要接收者（图 3B）。此外，PVR 和 NECTIN2 等细胞因子也参与了肿瘤免疫抑制微环境的构建。对 PVR 通路调控网络的分析表明，肿瘤细胞和内皮细胞是主要的发送者，而 Tex 等免疫抑制细胞则是接收者（图 3D）。更有趣的是，成纤维细胞亚群在这一调控网络中起着中介作用，这意味着该亚群可能成为新药的潜在靶点。NECTIN2 通路调控网络还显示了多种配体-受体模式；DCs、内皮细胞、成纤维细胞和 TAMs 是主要的发送者，Tregs、Teff 和 Tex 是主要的接收者（图 3C）。由于PVR和NECTIN2都能作用于TIGIT，与目前流行的PDL1/PDLD1阻断剂相比，TIGIT不仅可以逆转CD8 T细胞的衰竭状态，还能在一定程度上改善肿瘤免疫抑制微环境。因此，作者假设抑制 TIGIT 可以成为治疗 CRC 的一种新方法。作者的分析表明，Tex 在免疫抑制微环境中发挥着重要作用，而 CD8+ T 细胞的耗竭是 TME 不可避免的结果。

3. CD8+ T细胞衰竭过程中的代谢重塑

作者利用伪时间分析法构建了CD8+ T细胞的分化轨迹，其中效应记忆CD8+ T细胞出现在分化轨迹的初始位置，逐渐分化为Teff，***转化为位于分化轨迹末端的Tex（图2D）。众所周知，在癌症、自身免疫和慢性感染等慢性炎症情况下，Teff 会转化为 Tex。因此，作者确定了 Teff 和 Tex 的 DEGs，并进行了富集分析（图 2B、C）。结果发现，Teff 和 Tex 的代谢模式明显不同。葡萄糖代谢过程在 Teff 中富集，而脂质生物合成和胆固醇代谢途径等脂质代谢过程在 Tex 中高度富集。GSVA 也支持这一发现（图 2G）。作者提取了在分化轨迹中表达量增加的基因，然后进行了富集分析。脂肪酸生物合成、ω-3、-6 和-9 脂肪酸（FAs）合成等通路均被富集（图 2E）。这些结果表明，T细胞的分化与脂质代谢重塑有关，异常的脂质积累可能是Tex的能量来源。DEGs分析、伪时间分析和GSVA均表明，PPARG通路在Tex中高表达。之前的一项研究表明，PPAR 通路在脂质和脂蛋白水平的代谢调节中被激活。基于这些结果，作者推测 Tex 的脂质代谢重塑是由于 PPARG 通路的激活所致。为了验证这一假设，作者进行了 SCENIC 分析，以揭示 Tex 的异常转录调控网络。在没有悬浮液的情况下，PPARG 在 Tex 中明显富集。这进一步证明了 PPARG 转录因子可能在 Tex 的脂质重编程过程中发挥了重要作用。此外，作者还在 M1 模块中富集了 RORC、NR1D1 和 SREBF2 转录因子，它们也与脂质代谢密切相关。作者的研究结果表明，PPARG 和 SREBF2 等转录因子（TFs）可能参与了 Tex 的代谢重塑，并成为逆转这一过程的潜在靶点。

4. 髓系细胞

髓系细胞是TME中丰富的关键组成部分，是多种细胞类型的异质混合物，具有刺激和抑制肿瘤的活性。对髓系细胞的分析显示出五个不同的亚群：单核细胞、巨噬细胞、TAMs、DCs 和肥大细胞（图 4A）。其中，巨噬细胞和 TAMs 在外界条件和刺激因素的影响下可活化并极化为 M1（经典活化）和 M2（选择性活化）表型。M1 细胞通常表现出促炎症活性，而 M2 细胞则表现出以高水平免疫抑制标记物和抗炎因子为特征的肿瘤促进表型。

图4 在 CRC 中，巨噬细胞来自 M1 极化，而 TAMs 来自 M2 极化

有趣的是，当追溯到组织来源时，单核细胞主要存在于血液中，而巨噬细胞和 TAMs 则出现在大多数肿瘤组织中（图 4A）。伪时间分析表明，当单核细胞从血液中进入 TME 时分化为巨噬细胞，***分化为 TAM（图 4D）。

5. TAM 参与构建免疫抑制微环境

富集分析表明，巨噬细胞中富集了与促炎症相关的通路，如 IL-1、-2、-3、-11、-17、-18、-21、TNF alpha 和干扰素 alpha/beta 信号通路，同时巨噬细胞还表现出一些类似 M2 的功能，如 IL-4、-10 和 TGF-beta 受体信号通路（图 4B）。相反，与肿瘤促进和免疫抑制相关的通路在 TAMs 中富集，如花生四烯酸代谢、基质金属蛋白酶（MMP）、血管内皮衍生生长因子（VEGF）、IL-4、-10、-13 和 PD-1 信号转导。TAMs 中还存在一些类似 M1 的功能通路，如γ干扰素和 TNF 信号通路。GSVA 分析还显示，IFN α/β 信号在 TAMs 中富集，而 IL-5、-6、-7 和-17 则在巨噬细胞中富集（图 4C）。总之，巨噬细胞和 TAMs 表现出混合的 M1 和 M2 表型，其中巨噬细胞主要表现出 M1 表型，而 TAMs 主要表现出 M2 表型。结合上述结果与组织起源和假时分析，作者推测单核细胞从外周血进入肿瘤组织后，***初分化为 M1 型巨噬细胞，***分化为 M2 型 TAMs，同时增强了免疫抑制作用。

作者进行了 SCENIC 分析，以确定巨噬细胞向 TAMs 转化过程中 TFs 的变化（图 4F、G）。作者发现，STAT4、NFκB1、NFκB2 和 RUNX1 在巨噬细胞中富集，其中 STAT4 已被证实介导 JAK-STAT 相关通路，并参与 IL-12、-21、-23 和 -35 信号通路的传导。NFκB1 和 NFκB2 可促进巨噬细胞向 M1 型极化。相反，MAF、ETV5 和 EGR2 在 TAMs 中高表达，其中 MAF 调节 IL-4 通路的激活，ETV5 与血管生长和 IL-10 通路的激活有关 。研究发现，EGR2 的表达与 IL-4 和 TGF-β 功能通路的激活有关。

***，作者利用 CellChat 研究了 TAM 与 TME 中其他亚型细胞之间的相互作用（图 5D）。与巨噬细胞相比，TAMs 更多参与了免疫抑制微环境的构建。TAMs 分泌的免疫抑制配体，如 CD80、CD86、CD274、ICOSL 和 NECTIN2 与其他细胞，尤其是 T 细胞表达的 CTLA-4、PD-1、ICOS 和 TIGIT 等受体有明显的相互作用（图 5E-G）。除 IRS 外，TAMs 还分泌免疫抑制性可溶性细胞因子，如 IL-10 和 SPP1（图 5A）。有趣的是，TAMs 是 IL-10 的主要分泌者，而巨噬细胞是 IL-10 的主要接受者（图 5B）。这表明巨噬细胞和 TAMs 之间可能存在正反馈循环。一旦巨噬细胞分化为 TAMs，TAMs 可能会分泌 IL-10 作用于巨噬细胞以促进分化过程（图 5B）。TAMs 还能分泌 SPP1，它能介导巨噬细胞极化并促进肺腺癌的免疫逃逸。TAMs分泌的SPP1可与TME中的几乎所有细胞相互作用，包括DCs、Tregs、Tex、成纤维细胞和恶性细胞（图5C）。有趣的是，TAM 不仅是 SPP1 的主要分泌者，也是主要接受者。这可能与本研究中 TAMs 的 M2 表型有关。

图5 巨噬细胞与 TAMs 的相互作用网络

6. TAMs 中的脂质代谢重编程

TAMs 中与脂质代谢相关的基因（如 PPARA）高度表达。为了探索 TAMs 中是否存在类似于 T 细胞衰竭时的脂质代谢重塑，作者提取了巨噬细胞和 TAMs 的标记基因进行功能富集分析。结果显示，与巨噬细胞相比，TAMs富集了更多的脂质代谢通路，如胆固醇生物合成和脂肪酸代谢，如 "PPAR Alpha通路"。"固醇调节元素结合蛋白（SREBP）对胆固醇生物合成的调控 "和 "氧基甾醇受体 LXR-beta (NR1H2) 和氧基甾醇受体 LXR-α (NR1H3) 介导的信号传导"（图 4B）。GSVA 还进一步证实了 TAMs 中胆固醇和脂滴合成的增强（图 4C）。伪时间分析表明，在巨噬细胞分化过程中，与脂质输出相关的基因，如 ABCA1 和 ABCG1 的表达逐渐增强。作者有理由推测，巨噬细胞分化成 TAMs 的过程伴随着脂质代谢的重塑。

在TAMs中富集的功能通路中，有三个转录因子引起了作者的注意，即SREBF、NR1H2和NR1H3。进一步的 SCENIC 分析报告了 TAMs 中异常的转录调控网络。如图 4G 所示，模块 1 中的转录因子在 TAMs 中被显著激活，其中包括 SREBF 和 NR1H3。其中，SREBF 的功能是转录调控参与脂质生物合成和吸收的基因，促进脂肪酸合成并诱导 TAMs 的 M2 表型。NR1H2 和 NR1H3 是参与脂质代谢合成的转录因子，在转录水平上是 SREBP-1c 通路的重要调节因子，它们调节肝脏致脂细胞中与胆固醇转运和外流相关的基因表达。作者对 NR1H2 和 NR1H3 介导的胆固醇外流功能特别感兴趣。胆固醇外流的增加增加了 TME 中的脂质含量，为肿瘤细胞的生长提供了营养，并破坏了 TAM 的脂质筏，削弱了 Toll 样受体 4（TLR4）信号通路。它还增强了IL-4通路，削弱了干扰素通路，并在TAMs极化为M2方面发挥了意想不到的作用。作者推测，TAMs 中脂质代谢的重编程在一定程度上参与了免疫功能的重塑。

因此，SREBF和NR1H3在TAMs的脂质代谢重塑中发挥着重要作用。TAMs和Tex都经历了脂质代谢重塑，反映了脂质代谢在T细胞衰竭和TAMs极化为M2型过程中的重要作用。然而，这两种细胞之间存在着显著的差异，主要表现在转录调控因子的不同上。因此，作者怀疑SREBF和NR1H3可能是防止或逆转TAMs极化为M2的重要靶点。

7. 新陈代谢重塑和免疫抑制微环境构建

DCs 表现出与 TAMs 相似的模式 DCs 是免疫系统中***强大的抗原递呈细胞，是适应性免疫反应的核心参与者。DEGs分析显示，DCs高表达免疫抑制细胞因子，如IL-4、-10和IFNα/β。进一步的富集分析表明，IL-4、-10和-13、干扰素α/β、PD-1和CTLA-4抑制信号通路在DC中富集（图4B）。CellChat 分析发现，DCs 在分泌免疫抑制细胞因子方面表现出与 TAMs 相似的模式，尤其是 ICSO（图 5E）、CD80（图 5F）和 CD86（图 5G）。这些热图表明，DC 和 TAM 是参与 CD8+ T 细胞衰竭过程的主要分泌物，它们协同促进了免疫抑制微环境的构建。

同时，富集分析表明，脂质代谢、脂肪酸代谢和 PPARA 信号通路在 DCs 中高度富集（图 4B）。除了异常的脂质储存外，PPARs 通路还增强了 TCA 循环，导致柠檬酸积累。这些条件为脂肪酸和细胞内脂滴的从头合成提供了底物。其他途径也得到了丰富，包括 Wnt 信号传导和 CDK-beta-catenin 活性。事实证明，Wnt5可作用于DC上的Frizzled（FZD）家族受体，并通过激活β-catenin信号触发下游PPAR通路的激活，从而重塑黑色素瘤的脂质代谢（图4B）。RUNX2和RUNX3对Wnt信号的转录调控在DC中富集。SCENIC 分析表明，RUNX2 在 DCs 中高表达。这些结果表明，DCs的脂质代谢重塑可能也依赖于RUNX家族调控的核心Wnt/β-catenin/PPAR信号通路。基于上述分析，作者推测，DC 的脂质代谢重编程参与了免疫抑制微环境的重建。

8. 成纤维细胞

作者提取了 145 个成纤维细胞，并将其分为两组：成纤维细胞-1 和成纤维细胞-2（图 6A、B）。伪时间分析显示，成纤维细胞-1 出现在分化轨迹的初始阶段，而成纤维细胞-2 则出现在分化轨迹的末端。有趣的是，成纤维细胞-2 也分化成两种不同的亚型，即状态 2 和状态 3（图 6C）。

图6 成纤维细胞中类似的代谢和功能重塑

9. 成纤维细胞中相似的代谢和功能重塑

富集分析表明，与成纤维细胞-1 相比，成纤维细胞-2 更多参与细胞外基质（ECM）降解和受 MET 信号通路调控的细胞运动（图 6D）。有趣的是，两个集群之间的代谢模式完全不同。成纤维细胞-2 显著富集了与脂质胆固醇和脂肪酸代谢相关的通路。相比之下，成纤维细胞-1 表现出碳水化合物代谢模式（图 6E）。此外，成纤维细胞-2 的两个亚组都表现出 ECM 调节和脂质代谢模式，而状态 2 亚组与状态 3 相比，表现出更强的脂质代谢重塑、ECM 降解和受 MET 信号通路调控的细胞运动促进模式（图 6F）。其中，几个在成纤维细胞-2 中高度富集的通路引起了作者的注意，如 "NR1H2&NR1H3 调节与胆固醇转运和外流相关的基因表达"、"NR1H2 和 NR1H3 介导的信号转导 "和 "RUNX2 的转录调控"。SCENIC 分析还显示，NR1H2、NR1H3 和 RUNX 在成纤维细胞-2 中上调。这与 TAMs 的情况高度一致。以上结果表明，在成纤维细胞-1 向成纤维细胞-2 的分化过程中，也可能出现脂质代谢增强和脂质异常积累的现象。

10. 肿瘤教育免疫细胞的浸润与 CRC 预后较差有关

作者使用 CIBERSORTx 进行了数字细胞计数分析，以评估之前从癌症基因组图谱-结肠腺癌（TCGA-COAD）数据中分析的患者肿瘤基质细胞和免疫细胞亚群的丰度。作者利用逐步回归法建立了一个新的风险模型，以评估细胞分型与预后结果之间的关联，并确定训练队列中每个亚组的***系数。***，作者选择了 16 个亚组构建模型。

然后，作者评估了风险模型对总生存期（OS）的预后价值。在训练队列和测试队列中，高风险组患者的 OS 明显低于低风险组（分别为 p<0.001 和 p=0.03）（图 7A、B）。该模型的准确性通过与时间相关的接收者操作特征曲线（ROC）得到了验证，这证实了两个队列的预后的可靠性。在训练队列中，1、2 和 3 年 OS 的风险评分 ROC 曲线下面积分别为 0.823、0.774 和 0.696，而在测试队列中分别为 0.709、0.709 和 0.711。(图 7C、D）。此外，作者使用逐步多变量 Cox 回归法构建了一个新的临床模型，在训练队列中纳入了风险评分、TNM 分期、性别和年龄，并选择风险评分和 TNM 分期来构建模型。

图7 肿瘤教育免疫细胞的渗透与 CRC 预后恶化有关

有趣的是，风险评分和 TNM 分期都是独立的预后因素（分别为 p<0.001 和 p=0.038）。根据临床风险评分的中位数，患者被分为两个亚组。KM生存分析显示，在训练组和测试组中，高临床风险型患者的OS明显低于低临床风险型患者（分别为p<0.001和p=0.0012）（图7E、F）。在训练队列中，1 年、2 年和 3 年 OS 的 ROC 曲线下面积分别为 0.885、0.746 和 0.734，而在测试队列中，1 年、2 年和 3 年 OS 的 ROC 曲线下面积分别为 0.827、0.780 和 0.780。(图 7G 和 H），优于免疫风险模型。

作者还应用了其他已报道的免疫风险模型和TNM分期进行验证。高危/高分期（III-IV期）组患者的OS明显差于低危/低分期（I-II期）组（分别为p<0.001和p=0.015）（图S6B和S6A）。免疫风险模型的风险评分在1年、2年和3年OS的ROC曲线下面积分别为0.758、0.760和0.717，而TNM分期模型的风险评分在1年、2年和3年OS的ROC曲线下面积分别为0.726、0.636和0.650（图S6D、S6C）。

总结

该研究进一步揭示了TME的异质性和趋同性，尤其是各细胞亚群分化过程中高度一致的脂质代谢重塑和免疫抑制表型，为结直肠癌的靶向治疗和免疫治疗提供了新的视角。同时，利用CIBERSORTx算法整合scRNA-seq和大量RNA-seq数据，构建了免疫风险模型和临床风险模型，为结直肠癌患者的预后分析提供了参考价值。总之，这项研究为理解TME的异质性和趋同性提供了一个新的视角，将有助于开发治疗CRC的免疫疗法。