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导语

今天给同学们分享一篇多热点机制+预后+实验的生信文章“Identification and validation of a prognostic signature of autophagy, apoptosis and pyroptosis-related genes for head and neck squamous cell carcinoma: to imply therapeutic choices of HPV negative patients”，这篇文章于2023年1月10日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。

人乳头瘤病毒（HPV）阳性的HNSCC患者通常具有良好的生存率，并对放疗、化疗放疗和检查点阻断有良好的反应。然而，HPV阴性患者，也就是大多数HNSCC患者，一直被忽视。细胞死亡已经与癌症治疗抵抗有关。为此，作者旨在确定自噬、凋亡和焦亡相关基因与HNSCC预后的关联，并构建一个预后标志来预测HNSCC的预后，特别是HPV阴性的HNSCC。

1. 与头颈部鳞状细胞癌患者的总体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因

作者在TCGA数据集中使用单变量Cox回归分析筛选了48个与整体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因。与上述基因的临床病理特征相关的特征显示在图1A中。使用LASSO回归模型选择了27个基因，使用逐步多元Cox回归模型选择了16个基因。这16个与整体生存相关的基因包括五个与凋亡相关的基因（BCAP31、CDKN2A、FNTA、STK24和YWHAQ）、十个与自噬相关的基因（ATG5、CSNK2A2、DYNC1I1、MVB12A、MVB12B、RRAGA、TSG101、PRKN、VDAC1和VPS37C）以及一个与焦亡相关的基因（NLRP1）（图1B）。随后作者分析了这些与整体生存相关的基因之间的相关性（图1C）。STK24与YWHAQ呈正相关，与MVB12A呈负相关，而DYNC1I1与PRKN呈正相关，相关系数***值超过0.4。

图1 整体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因的鉴定

2. 细胞死亡指数是头颈部鳞状细胞癌患者总体生存的独立预后指标

基于16个与总生存相关的基因，作者建立了自噬、凋亡和焦亡指数以及综合细胞死亡指数（CDI）。TCGA数据集中，CDI得分高的HNSCC患者的总生存率较差（中位数为20个月，95%置信区间[CI]为18至29个月），与CDI得分低的患者相比（中位数为110个月，95% CI为90个月至未达到）。这一发现在GEO数据集（GSE42743和GSE65858）以及山东大学齐鲁医院的数据集中得到了进一步验证（图2A）。类似的趋势也在CDI得分高的患者中观察到，他们的总生存率较差，与CDI得分低的患者相比（分别为GSE42743中的中位数11个月对35个月，GSE65858中的57个月对62个月，以及齐鲁医院队列中的24个月对未达到）。

图2 CDI是HNSCC整体生存率的独立预后指标

ROC分析显示，CDI在预测一年、三年、五年和十年总生存期方面表现出色，其ROC曲线下面积（AUC）分别为0.773、0.779、0.739和0.791（图2E）。自噬指数、凋亡指数、火凝亡指数和16个总生存期相关基因的AUC低于CDI。此外，CDI对于预测五年总生存期的AUC高于其他潜在的生存相关因素，包括年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、肿瘤分级和HPV状态（图2F）。在单因素Cox回归模型中，CDI、凋亡指数和自噬指数与不良预后相关，而火凝亡指数与良好预后相关（危险比[HR]为4.00，95% CI为2.90-5.70，P <0.001，分别为CDI，HR为2.60的凋亡指数，HR为3.60的自噬指数和HR为0.61的火凝亡指数，图2G）。在多因素Cox回归模型中，CDI是独立的总生存期预后指标，在调整年龄、性别和TNM分期后（HR为3.80，95% CI：2.70-5.40，P <0.001，图2G）。

作者还基于多变量Cox模型开发了一个基于TCGA数据集的图表模型，用于预测HNSCC患者一年、三年和五年的总体生存概率（图2H）。该图表显示，CDI是***的贡献因素，其次是年龄、TNM分期和肿瘤分级。在校准图中，观察到的和图表预测的总体生存曲线非常吻合（图2I）。作者的图表模型表现可靠，具有0.735的一致性指数（C-index）。

3. CDI对HPV阴性的头颈部鳞状细胞癌患者具有更强的预后效果，高CDI头颈部鳞状细胞癌患者通过放疗获得生存益处

作者进一步研究了CDI对整体生存率的影响，根据基线因素和其他已知影响生存率的因素，在TCGA数据集中进行了分层分析（图3A、B）。在除HPV阳性HNSCC患者外的所有亚组中，发现了类似的趋势。这一有趣的发现解决了作者对HPV状态分层的关注，尤其是对于大多数HNSCC，即HPV阴性患者。

图3 CDI对HPV阴性HNSCC患者显示出更强的预后效应，并与放疗的生存益处相关

为了评估高或低CDI分数的HNSCC患者是否从放疗或化疗放疗中获得不同的生存益处，作者使用TCGA数据集分析了高和低CDI HNSCC患者根据辅助治疗分层的总体生存概率（图3C，D）。在接下来的分析中，只有一个接受单独化疗的患者被排除在外。接受放疗的HNSCC患者在高CDI亚组中显示出良好的总体生存率，但在低CDI亚组中没有（P = 0.009和P = 0.938，分别，图3C）。值得注意的是，在HPV阴性亚组（P = 0.059，图3D）和HPV阳性患者（P = 0.045）中也发现了类似的趋势。综上所述，这些发现表明，尽管高CDI分数的HPV阴性患者表现出***差的预后，但他们仍可能从放疗中获得总体生存益处。

4. 低CDI HNSCC患者在HPV阴性HNSCC亚组中表现出活跃的免疫微环境

作者使用TCGA数据集评估了高和低CDI HNSCC患者的免疫环境。低CDI评分的HPV阴性HNSCC患者显示出更高的免疫评分和微环境评分（图4A）。然而，在HPV阳性患者中，高CDI和低CDI亚组之间的上述评分差异并未发现。为了评估具有不同CDI评分的HNSCC患者的免疫细胞浸润情况，作者应用了去卷积算法（图4B，S5C）。在HPV阴性和阳性HNSCC患者中，高CDI亚组中的静息记忆CD4 T细胞和M0巨噬细胞浸润更高。然而，在HPV阴性HNSCC亚组中，只有低CDI亚组中才有更多的原始B细胞、CD8 T细胞、活化记忆CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞和静息肥大细胞。

图4 高和低CDI HNSCC在HPV阴性亚组之间的免疫景观

此外，为了评估CDI评分在免疫检查点阻断中的潜在疗效，作者使用TCGA数据集检查了HNSCC患者高CDI亚组和低CDI亚组之间14个关键免疫检查点基因的表达情况。作者发现，在HPV阴性的HNSCC患者中，CTLA4、IDO1、TIM3、LAG3、PD1、SIGLEC10、LILRB1和NKG2A的表达在低CDI亚组中增加（图4C），但在HPV阳性的HNSCC患者中没有增加。这表明，CDI评分低的HPV阴性患者可能会从检查点阻断治疗中获益。

5. 低CDI HNSCC患者在HPV阴性HNSCC亚组中显示了与免疫功能相关通路的基因富集

考虑到CDI对HPV阴性和HPV阳性患者的不同预后影响，以及HPV阴性HNSCC患者中高CDI和低CDI亚组之间的不同免疫微环境，作者进一步分析了具有不同CDI评分的HPV阴性HNSCC患者的差异表达基因。共鉴定出288个差异基因，其中51个基因在高CDI亚组中上调表达，237个基因在高CDI亚组中下调表达（图5A）。

图5 不同CDI评分的HPV阴性HNSCC患者的功能丰富性

GO富集分析显示，低CDI亚组中上调基因主要富集在与免疫功能相关的通路中，包括免疫系统过程调节、淋巴细胞激活、免疫应答调节、淋巴细胞激活调节、B细胞激活、B细胞分化和B细胞增殖。然而，高CDI亚组中上调基因很少富集在与免疫功能相关的通路中（图5B、C）。

KEGG富集分析显示，高CDI亚组中上调基因主要富集在与代谢相关的途径中，包括色氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢。而低CDI亚组中上调基因主要富集在与免疫功能相关的途径中，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原处理和呈递、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用和T细胞受体信号通路（图5D、E）。

6. 两个HPV阴性HNSCC细胞系中与总生存相关的十六个基因的表达

为了验证数据库分析的结果，作者使用qRT-PCR测量了两种HPV阴性HNSCC细胞（CAL27和SCC-15）中与总体生存相关的16个基因的基线mRNA表达水平（图6A）。在自噬抑制剂氯喹（CQ）的作用下，CAL27和SCC-15细胞的细胞存活率显著受到抑制（图6B）。此外，作者发现CQ在两种细胞系中诱导了凋亡（图6C，D）。自噬相关蛋白（LC3和p62）在CQ的作用下被诱导，bcl-2减少，caspase-3被剪切，表明CQ可能抑制自噬并诱导凋亡（图6E）。除了两个低表达基因（PRKN和MVB12B）外，上述与总体生存相关的基因在CAL27细胞系中在CQ处理后均被诱导。在SCC-15细胞系中，DYNC1I1、CSNK2A2和TSG101在CQ处理后被诱导，MVB12A减少（图6F）。

图6 验证16个与总生存相关基因在两种HPV阴性HNSCC细胞系中的表达情况

7. 辐射诱导HPV阴性HNSCC细胞系中的细胞凋亡和VDAC1表达

作者进一步确定了一个不同表达的基因VDAC1，在HPV阴性HNSCC患者的辐射敏感和辐射耐受亚组之间（图7A）。VDAC1的表达在辐射敏感亚组中显著降低。体外实验中，CQ和/或辐射显著抑制了CAL27和SCC-15细胞系的细胞存活率（图7B）。作者进一步发现，CQ和/或辐射诱导了CAL27和SCC-15细胞系的凋亡（图7C，D）。此外，VDAC1在CQ和/或辐射处理后在CAL27和SCC-15细胞系中被诱导表达（图7E）。

图7 辐射增强了HPV阴性HNSCC细胞系中VDAC1的表达

总结

总之，作者确定了16个与自噬、凋亡和焦亡相关的基因，并构建了一个细胞死亡指数（CDI），CDI能够独立预测HNSCC患者的预后。CDI得分高的HNSCC患者可能会从放疗中受益，而HPV阴性且CDI得分低的患者可能会从检查点免疫疗法中获得潜在的益处。作者的研究结果不仅建立了一个预后标志，还强调了它在HPV阴性HNSCC患者中的治疗选择的实施，这是HNSCC的大多数患者和预后不良的人群。