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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of therapeutic targets for osteosarcoma by integrating single-cell RNA sequencing and network pharmacology”，这篇文章于2023年1月6日发表在Front Pharmacol期刊上，影响因子为5.6。

骨肉瘤（OS）是一种恶性肿瘤，主要发生在儿童和青少年身上，占全球原发性骨肿瘤的20%。目前，骨肉瘤的治疗方法主要包括手术、化疗和放疗。然而，目前对骨肉瘤的治疗方法仍然不尽人意，总体5年生存率为65%至70%。因此，迫切需要开发新的骨肉瘤治疗选择。

1. 细胞群集的识别和降维分析

通过scRNA-seq分析，鉴定出了21个细胞亚型和八种细胞类型（图1A、B）。八种细胞类型的标记基因表达在不同细胞类型之间存在差异（图1C）。KEGG富集分析显示八种细胞类型的标记基因在富集通路上存在显著的异质性（图1D）。

图1 细胞群集的鉴定和降维分析

2. 不同细胞类型的收集

为了进一步筛选OS中的不同细胞类型，使用CIBERSORT算法分析了GSE36001数据集中OS和正常组织中八种细胞类型的丰度（图2A）。研究表明，免疫检查点TDO2、PDCD1、LGALS9和PVR在癌症治疗和预后中起着重要作用（Stamm等，2018；Fan等，2020；Miao等，2020；Cui等，2022）。基于Pearson相关分析，筛选出与免疫检查点表达水平显著相关的细胞丰度，并结果显示B细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞和浆细胞的丰度分别与免疫检查点TDO2（p = .043）、PDCD1（p = .017）、LGALS9（p = .017）和PVR（p = .026）显著相关（图2B）。

图2 不同细胞类型的收集

3. 筛选出关键基因

从Genecards和DisGeNET数据库中检索到了共计4,236个与OS相关的靶点。接下来，与四种细胞类型的标记基因进行交集，作者得到了289个共同的靶点（图3A）。***，通过Pearson相关性分析进一步筛选，得到了17个关键靶点（GZMB、IL1A、IGFBP4、JUN、KDR、CD2、FLT1、CCR7、CD4、COL9A3、SPRY4、OMD、RUNX2、PTPRG、HSPA1A、SOX18和PDGFRB），这些靶点与四种差异细胞的丰度显著相关（图3B）。

图3 筛选出OS的关键目标

随后，作者通过TARGET数据库获得了与OS生存时间信息相对应的17个关键靶点的表达数据。通过多元Cox回归分析，这五个靶点（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN）可能是重要的预后因子。基于多元Cox回归算法构建了由这五个基因组成的联合预后标记模型。结果显示，这五个关键基因能够准确评估OS的风险（p = .0019，图4A）。此外，在OS的3年和5年生存分析中，ROC曲线下的面积（AUC）值大于0.72（图4B）。

图4 OS中五个关键靶点（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）的预后分析

此外，癌细胞可以通过调节免疫检查点蛋白来逃避免疫反应。为了验证五个关键基因的高风险和低风险分组的准确性，检测了免疫检查点BTLA和PDL1的表达。低风险组中BTLA和PDL1（CD274）的表达水平高于高风险组（图4C）。

4. PPI网络构建和功能富集分析

通过使用STRING数据库对17个关键靶点进行PPI网络分析，共获得161对互补关系（图5）。进行了GO和KEGG富集分析以探索这17个关键靶点的功能。GO富集分析显示出787个富集通路（p <.05），其中生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）的前五个通路如图6A所示。BP主要与ERK1和ERK2级联、MAPK级联和趋化作用相关。CC位于转录调节因子复合物、RNA聚合酶II转录调节因子复合物和细胞外侧的质膜。MF与DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异性、生长因子结合和蛋白酪氨酸激酶活性相关。同时，KEGG富集分析在77个通路（p <.05）中富集，主要包括MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和人T细胞白血病病毒一感染（图6B）。

图5 17个关键靶点的蛋白质相互作用（PPI）网络

图6 17个关键靶点的功能丰富分析

5. 药物-靶点相互作用预测

使用deepDR算法，获得了与OS高分关联的十种药物。使用DeepPurpose算法预测了17个关键靶点与这十种药物之间的相互作用关系（图7）。筛选得分大于75%四分位数的结果得到了六种药物（DB04572、DB01005、DB01234、DB00541、DB00570和DB00309），可能作用于17个关键靶点。

图7 药物靶点相互作用评分分散点

为了确认这六种药物是否适用于骨肉瘤的治疗，作者使用AutoDock Vina对六种药物和CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN进行了分子对接分析。对接结果显示，RUNX2与长春新碱（DB00541）、长春碱（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的结合亲和力；OMD与长春新碱（DB00541）、长春碱（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的结合亲和力；CD4与长春新碱（DB00541）、长春碱（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的结合亲和力（图8）。

图8 对VCR、DEX和VLB与RUNX2、OMD和CD4的分子对接分析

6. 细胞验证试验

为了评估关键靶点对OS的预后效果，使用qRT-PCR检测CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN在OS和成骨细胞中的表达。结果显示，与hFOB1.19细胞相比，OS细胞中CD4、OMD和JUN的表达下降，而RUNX2和COL9A3的表达增加（p < .01；图9）。

图9 使用qRT-PCR检测了CD4、OMD、JUN、COL9A3和RUNX2的相对表达水平

总结

总之，根据细胞丰度的差异，在OS和正常组织中鉴定出四种细胞类型（B细胞、CAFs、内皮细胞和浆细胞）。作者确定了五个与OS进展相关的关键靶点（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）。GO和KEGG分析表明，这五个基因与免疫调节途径有关。长春新碱、地塞米松和长春碱可能与RUNX2、OMD和CD4形成一对有前景的药物靶点，用于OS治疗。然而，作者的研究仍然存在不足。例如，作者只对生物信息学结果进行了简单的实验验证，作者的结果缺乏临床结果的支持。作者的研究确定了治疗OS的潜在靶点。