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导语

今天给同学们分享一篇调控基因+分型+甲基化的生信文章“Prognostic Value and Genome Signature of m6A/m5C Regulated Genes in Early-Stage Lung Adenocarcinoma”，这篇文章于2023年3月30日发表在

Int J Mol Sci期刊上，影响因子为5.6。

RNA修饰在癌症的发展和进展中具有病理和预后意义，其中m6A和m5C是代表性的调节因子。这些RNA修饰可以通过调节基因表达对其他RNA的功能产生影响。因此，在本研究中，作者旨在探索m6A/m5C调节因子与早期肺腺癌（LUAD）之间的相关性。

1. 基于m6A/m5C相关基因的早期LUAD分子亚型鉴定

本研究使用TCGA-LUAD早期患者进行研究。根据37个m6A/m5C调控基因的mRNA表达，采用无监督聚类方法对早期LUAD患者进行亚型分析。作者选择了两个作为***的k值，将402名患者分为cluster1（N = 240）和cluster2（N = 162）（图1A）。此外，在可视化PCA算法的结果时，作者发现聚类判别效果非常好，进一步证实了早期LUAD的两个明显不同的亚型。K-M生存分析显示m6A/m5C相关聚类之间的OS存在显著差异，cluster1的患者的OS明显优于cluster2的患者（log-rank检验p < 0.05）（图1B）。两个聚类中m6A/m5C相关基因的表达及其与临床特征的相关性如图1C所示。大多数基因在cluster2中高表达，并且两个聚类的性别和分期特征有显著差异。此外，性别差异（p < 0.01）和生存状态（p < 0.05) 在两个早期LUAD亚型之间。

图1 早期LUAD中m6A/m5C相关基因的共识聚类

2. 早期LUAD中m6A/m5C亚型的免疫微环境

文章鉴定了六种全癌症的免疫亚型，包括C1（伤口愈合型）、C2（IFN-γ优势型）、C3（炎症型）、C4（淋巴细胞减少型）、C5（免疫沉默型）和C6（TGF-β优势型）。进一步比较了两个m6A/m5C亚型之间的免疫亚型特征，结果显示cluster2中C1亚型的比例较高，而C3、C4和C6亚型的比例较低，这些亚型与预后不良相关（图2A）。为了探索两个m6A/m5C相关聚类之间的免疫特征差异，作者使用Estimate、MCPcounter和CIBERSORT算法分析了免疫细胞浸润的异质性。结果显示两组之间的免疫评分存在显著差异。cluster1的免疫评分高于cluster2（p = 0.00061）。此外，cluster2的基质评分低于cluster1（p = 0.01172，图2B）。cluster1和cluster2之间的免疫细胞比例存在显著差异。与cluster1相比，cluster2表现出T细胞、CD8+ T细胞、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞、单核细胞系细胞、中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及巨噬细胞M0和M1的表达增加。此外，cluster2显示出髓样树突状细胞、T细胞CD4记忆静止状态以及静止状态肥大细胞的浸润较低（图2C、D）。如图2E所示，cluster2表现出六个免疫检查点基因的高表达，表明存在免疫逃逸的趋势。随后，作者还探索了两个亚型之间不同趋化因子基因的表达差异。在41个趋化因子中，有25个在两个亚型之间显示出统计学上的显著差异，而18个趋化因子受体基因中的11个在两个m6A/m5C相关亚型之间表达不同。有趣的是，大多数趋化因子和趋化因子受体基因在cluster2中的表达较高。细胞溶解活性（CYT）显示cluster2中的CYT显著高于cluster1。同时，作者研究了两个亚型与主要组织相容性复合体和HLA家族基因之间的关系。14个主要组织相容性复合物和HLA家族基因的表达水平在cluster2中相对较高。

图2 TCGA-LUAD早期阶段的m6A/m5C亚型的免疫景观

3. 早期肺腺癌患者的体细胞改变格局在不同亚型中的展示

通过TCGA早期LUAD数据集分析体细胞突变，并创建瀑布图来描述2个聚类中前20个突变基因。在聚类1和聚类2中，***常见的突变基因分别是TP53和TTN。在这些体细胞突变中，有436个基因在2个聚类之间的突变频率有显著差异（p < 0.05）。此外，对于LUAD常见突变的致癌基因和抑癌基因，SMARCA4、ERBB4、CDKN2A、WNT10B、ROS1、TTN和TP53的突变频率在聚类2中较高（图3A，B）。聚类1的肿瘤突变负荷（TMB）低于聚类2（p = 0.00089）（图3C）。在CNA方面，与聚类1相比，聚类2表达更多的CNA负担、扩增和缺失（图3D-F）。

图3 m6A/m5C亚型的体细胞变异

突变标识分析显示，早期肺腺癌（LUAD）与三个标识有关。标识1与APOBEC胞嘧啶脱氨酶（COSMIC_13）有关。标识2类似于DNA错配修复（COSMIC_6），发生在微卫星不稳定的肿瘤中，并与DNA错配修复的丧失有关。标识3与吸烟有关（COSMIC_4）。两个亚型之间的三个标识的比例明显不同。

4. 亚型之间的差异表达基因（DEGs）鉴定和功能分析

根据 p < 0.05 和 |log2FC| > 1 的阈值，共筛选出1625个差异表达基因(DEGs)在cluster1和cluster2之间，其中51个基因上调，1574个基因下调（图4A）。此外，GO注释分析显示，DEGs富集在295个生物过程中，如核分裂和染色体分离，56个细胞组分中，包括染色体区域和紧凑染色体，以及22个分子功能，例如单链DNA解旋酶活性和DNA解旋酶活性（p.adjust < 0.05）。图4C-E显示了前15个注释，GO注释的原始分析统计数据列在表S4中。此外，KEGG富集分析显示，DEGs参与了315个通路（p.adjust < 0.05），包括Fanconi贫血通路、p53信号通路、同源重组和其他与肿瘤相关的通路（图4F）。

图4 m6A/m5C亚型之间的差异分析和功能分析

为了确定2个m6A/m5C相关的亚型激活途径之间的差异，作者使用MSigDB v7.5进行了GSVA分析，并发现这两个亚型显示出72个不同的途径（p.adjust < 0.01）。详细的GSVA富集结果如表S6所示。热图显示，亚型1在肠道免疫网络的iga产生、糖脂类代谢和合成神经节系列等方面显著富集，而亚型2在DNA复制、错配修复、同源重组等方面富集（图4B）。同时，GSEA分析证实了这两个m6A/m5C亚型之间52个途径的差异（p.adjust < 0.05）。

5. 鉴定 Cluster2 特定关键基因

作者发现在Dep map数据库中，709个基因在LUAD细胞系的生存中起着重要作用。在这709个候选基因中，有78个在cluster2中表达相对较高（图5A）。然后，作者根据这78个基因的表达情况探索了生存情况，生存分析显示有9个基因（CCNA2、CDC6、RACGAP1、SGOL1、TICRR、RRM2、BUB1B、KIF23和CDK1）在TCGA和GEO数据库（GSE72094和GSE50081）中具有预后意义。在早期LUAD患者中，这九个基因的高表达水平与TCGA-LUAD、GSE72094和GSE50081中的不良预后相关（图5B）。此外，这九个基因与大多数m6A/m5C相关的调控基因呈显著正相关。

图5 早期LUAD预后标志物的筛选

6. m6A/m5C相关预后模型的构建

使用TCGA队列中具有OS信息的早期LUAD患者建立了预测模型。通过LASSO-Cox回归（图6A、B）和多变量Cox分析（图6C），从37个m6A/m5C相关调控基因中筛选出了***预后标志物。***终，基于七个m6A/m5C相关调控基因（METTL3、NPLOC4、RBM15、YTHDF1、IGF2BP1、NSUN3和NSUN7）构建了一个预后模型。

图6 m6A/m5C相关预后模型的构建

根据基因表达计算了每个样本的风险评分，并绘制了样本的风险评分分布（图6D）。此外，为了评估七个m6A/m5C相关调控基因在蛋白质水平上的表达情况，作者利用HPA数据库获取了免疫组化图像。从图S9可以直观地看出，与正常组织相比，肿瘤组织中5个m6A/m5C相关调控基因的蛋白质表达显著增加。

根据风险评分，TCGA数据集中的患者被分为高风险组和低风险组。对训练和测试数据集进行Kaplan-Meier（KM）生存分析，以评估m6A/m5C相关签名评分的预测能力。在TCGA数据集中，高风险患者的总生存期较低风险患者差（p = 0.0049，图7A）。在测试数据集（GSE72094和GSE50081）中也观察到类似的结果（图7C、E）。同时，时间依赖的AUC显示m6A/m5C相关签名评分在TCGA和GEO数据集中对早期LUAD患者的总生存期预测具有显著意义。TCGA在预测1年、5年和10年预后的时间依赖AUC值分别为0.653、0.643和0.791（图7B）。对于GSE72094的预测，1年、3年和5年的OS曲线下面积分别为0.667、0.611和0.736（图7D）。此外，GSE50081中1年、3年和5年生存的时间依赖AUC值分别为0.620、0.628和0.605（图7F）。

图7 训练集和测试集中七个基因标识的验证

此外，分析了TCGA-LUAD数据集中配对肿瘤和正常样本之间上述7个风险基因的不同mRNA表达，显示早期LUAD中的表达明显上调（图8A）。为了进一步探索7个m6A/m5C调节基因的mRNA表达水平，利用16对LUAD的冷冻新鲜肿瘤组织和癌旁组织进行了qRT-PCR实验。尽管这七个基因的表达在正常组织和肿瘤组织之间没有显著差异，但LUAD中的七个基因mRNA表达水平相对高于正常人肺细胞，这与TCGA结果一致（图8B）。来自LUAD患者的16对肿瘤和正常样本的RT-qPCR实验的2−（∆∆Ct）值此外，分析了TCGA-LUAD数据集中配对肿瘤和正常样本之间上述7个风险基因的不同mRNA表达，显示早期LUAD中的表达明显上调（图8A）。为了进一步探索7个m6A/m5C调节基因的mRNA表达水平，利用16对LUAD的冷冻新鲜肿瘤组织和癌旁组织进行了qRT-PCR实验，引物序列如表1所示。尽管这七个基因的表达在正常组织和肿瘤组织之间没有显著差异，但LUAD中的七个基因mRNA表达水平相对高于正常人肺细胞，这与TCGA结果一致（图8B）。

图8 七种风险基因的mRNA表达

总结

m6A/m5C甲基化修饰可以调节早期LUAD中重要预后基因的表达和癌基因的改变。m6A/m5C调节的基因可能参与T细胞耗竭和信号转导途径的进展，如DNA复制和错配修复，这可能进一步导致早期LUAD的不良预后和进展。鉴于m6A/m5C调节基因的调节已被确定为早期LUAD的重要预后生物标志物，研究能够靶向m6A/m5C的治疗药物可能是一种有前景的方法。RNA修饰蛋白可能是理想的治疗靶点，目前大多数酶都有生物结构，这使得药物开发变得方便。总之，m6A/m5C调节因子可能成为早期LUAD的潜在治疗靶点和预测性生物标志物，未来需要更多深入的临床研究来验证。