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导语

今天给同学们分享一篇双硫死亡+分型+预后模型的生信文章“Identification of disulfidptosis related subtypes, characterization of tumor microenvironment infiltration, and development of DRG prognostic prediction model in RCC, in which MSH3 is a key gene during disulfidptosis”，这篇文章于2023年6月23日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。

肾细胞癌（RCC）是全球***常见的肾癌亚型，在泌尿系统***常见的恶性肿瘤中排名第二。RCC的特点是无症状、高死亡率、高复发率、易转移和易于产生治疗耐受性。这使得许多RCC患者在诊断时已经晚期，预后通常较差。幸运的是，随着全球医疗标准和医学研究的快速发展，治疗RCC的疗效显著提高。然而，RCC患者的总体5年生存率（OS）仍然不理想。更糟糕的是，即使接受手术治疗的RCC患者也可能在手术后出现转移和复发。一些文献表明，转移性RCC患者的5年生存率甚至低于10%。因此，迫切需要找到能够有效预测RCC患者预后并为RCC治疗提供新的治疗见解的新的预后生物标志物。

1. 24个DRGs在RCC中的差异表达和预后价值

作者调查了541例RCC患者和72例从TCGA-KIRC数据集中获取的正常人肾组织中24个DRG的表达水平，结果显示大多数24个DRG在肿瘤组和正常组之间表达差异显著（图1A）。对RCC中的24个DRG进行了Kaplan-Meier生存分析，发现其中21个与RCC患者的OS密切相关，作者只展示了其中的15个（图1B-P）。ACTN4、FLNA、FLNB、LRPPRC、MYH9、MYH10、NCKAP1、NDUFS1、NUBPL、OXSM和TLN1在高表达患者中具有更好的OS，相反，ACTB、CAPZB、GYS1和SLC7A11高表达患者的OS较差。

图1 TCGA-KIRC数据集中24个DRG的表达水平和Kaplan-Meier生存分析

2. 鉴定肾癌中的双硫死亡异常亚型和遗传亚型

根据TCGA-KIRC和GSE29609数据集中571个RCC样本的DRGs表达水平，进行双硫死亡型分型。共识累积分布函数（consensus CDF）图显示了在不同聚类数κ下的CDF分布。当κ=3时，CDF分布较为平坦且接近***值，而在κ=4时，CDF曲线下的面积相对较不明显。因此，作者选择了κ=3时的聚类结果（图2A），并将样本分为三个双硫死亡型亚型（图2C）。PCA结果显示这三个亚型有明显差异（图2E）。通过limma软件包鉴定出了这三个亚型之间的1566个差异表达基因（DEGs）（图3A），然后根据DEGs的表达水平对571个RCC进行了基因分型，CDF分布和Delta面积图的结果表明在κ=3时获得了***的聚类结果（图2B）。三个遗传亚型的一致性矩阵（图2D）和PCA结果（图2F）显示了良好的区分度。生存分析结果显示，双硫死亡亚型中***长的OS是亚型A（n=185），其次是亚型C（n=251），***差的是亚型B（n=135）（图2G）。而在基因型中，***差的OS是亚型C（n=90），其次是亚型B（n=266），***的是亚型A（n=215）（图2H）。根据CIBERSORT方法的结果，三种双硫死亡亚型之间的免疫细胞浸润存在显著差异（图2I）。激活的B细胞、激活的CD4 T细胞、激活的CD8 T细胞、激活的树突状细胞、CD56明亮的自然杀伤细胞、CD56暗的自然杀伤细胞、γδT细胞、未成熟的B细胞、MDSC、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞、T辅助细胞1型、T辅助细胞2型在A亚型中浸润水平***，嗜酸性粒细胞、未成熟的树突状细胞和自然杀伤细胞在C亚型中浸润水平***，而中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞在B亚型中浸润水平***。此外，作者还对三种基因型之间的DRG表达水平进行了差异分析，结果显示21个DRG在这三种遗传亚型之间表达差异显著（图2J）。

图2 RCC亚型的测定和相关性分析

图3 基于差异表达基因（DEGs）的功能富集分析和DRG预测模型构建

3. 基于与亚型相关的差异表达基因（DEGs）构建预测风险模型

如图3A所示，通过交集三个亚型的差异基因集，获得了1566个差异表达基因（DEGs）。然后，作者对这1566个DEGs进行了GO分析（图3B）和KEGG分析（图3C）。蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白降解过程、调节肌动蛋白细胞骨架组织、肌动蛋白聚合或解聚、正调控WNT信号通路以及硫化合物生物合成过程是生物学过程（BP）方面的主要富集项。泛素连接酶复合物、肌动蛋白丝、肌动蛋白肌肉、皮质细胞骨架以及蛋白酶体复合物是细胞组分（CC）方面的主要富集项。肌动蛋白结合、Ras GTP酶结合、泛素样蛋白转移酶活性、蛋白结合、桥接以及NADP结合是分子功能（MF）方面的主要富集项。调节肌动蛋白细胞骨架、MAPK信号通路、癌症中的蛋白聚糖、泛素介导的蛋白质降解、鞘脂信号通路、癌症中的胆碱代谢、NF-kappa B信号通路、Th1和Th2细胞分化、PD-L1表达和PD-1检查点通路以及多种物种的凋亡是KEGG通路方面的主要富集项。然后，通过R软件的Caret包，将571个样本随机分为训练组（n=285）和测试组（n=286）。通过对1566个差异表达基因进行单变量Cox回归分析，筛选出1187个与生存期相关的基因。随后，作者对1187个与OS相关的基因进行了LASSO Cox回归分析（图3D，E），***终确定了五个基因来构建DRG风险模型。

每个队列根据中位数风险评分被分为高风险组和低风险组。两组之间24个DRG的表达水平差异分析显示，在高风险组和低风险组之间有19个DRG的表达存在差异（图3F）。生存分析结果显示，高DRG风险组的RCC患者的总生存期比低DRG风险组的患者更差，无论是在训练队列还是测试队列中（图3G，H）。这些结果表明，DRG风险模型和与之相关的基因是RCC患者的关键预后标志物。

4. 临床特征、生存状况和风险评分之间的相关性分析

风险曲线和生存状态图的结果显示，患者的生存状态与风险评分之间存在强烈的正相关性，并且在训练队列（图4A）和测试队列（图4B）中，高风险组和低风险组之间的五个模型基因的差异表达保持一致。随时间变化的ROC曲线显示，DRG风险模型在预测训练队列（图4C）和测试队列（图4F）的1年、3年和5年生存率方面具有良好的准确性。PCA结果显示，与直接用于区分RCC样本的24个DRG相比（图4D），作者的DRG风险模型能够准确区分高风险组和低风险组的RCC样本（图4G）。此外，作者还研究了风险评分与临床特征的关系，并结合患者的临床特征，结果显示晚期RCC患者的风险评分较高（图4E）。基于TCGA数据库的全癌症文件预测患者的PFS的结果显示，高风险组的患者PFS较差（图4H）。对于上述结果，作者得出结论：在组织学分级、病理分期和预后方面，DRG风险评分与RCC患者之间存在显著关联。

图4 生存状态、DRG评分和临床特征之间的相关性分析结果

5. 评估预测效果，并进行独立预后分析

根据获得的临床数据文件和风险文件，作者通过R软件的rms包绘制了一个诺莫图，用于预测患者在1年、3年和5年的存活可能性（图5A）。校准图和ROC曲线的结果显示，该诺莫图在预测存活方面达到了令人满意的准确性（图5B、C）。DCA决策曲线的结果显示，该诺莫图在预测患者5年存活可能性方面***为有效（图5D-F）。随后，作者将风险评分与临床特征结合进行了单变量和多变量Cox回归分析，结果显示，基于五个基因的风险模型、年龄、组织学分级和病理分期均为独立的预后因素（图5G、H）。

图5 风险评分的标尺制定和独立预后分析的发展

6. 基于DRG风险评分的免疫景观和免疫治疗敏感性

根据CIBERSROT算法显示的DRG风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性，作者仅选择了十种类型的免疫细胞，并且结果显示DRG风险评分与B细胞记忆、活化NK细胞、浆细胞、活化T细胞CD4记忆、T细胞CD8、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞（Tregs）呈正相关，与M2巨噬细胞、单核细胞、γδT细胞呈负相关（图6A）。这五个模型基因也与免疫细胞浸润呈强相关（图6B）。免疫功能富集分析结果显示，高风险组富集在CCR、细胞溶解活性、促炎、副炎症、T细胞共刺激和I型干扰素反应上，而低风险组富集在MHC-I类和II型干扰素反应上（图6C）。TIDE评分评估显示高风险组更有可能发生免疫逃逸，表明患者更不可能从免疫疗法中获益（图6D）。TME评分结果显示，高风险组和低风险组之间的免疫细胞评分和综合评分存在显著差异，而基质细胞评分则没有显著差异（图6E）。

图6 与风险评分相关的肿瘤微环境浸润结果、免疫功能分析结果和TIDE评分结果

7. 分型结果、体细胞突变、危险组和功能富集分析之间的关系

桑基图显示了基于三种残疾表型、三种基因型和DRG风险亚组的患者比例（图7A）。不同的亚型有不同的风险评分。在不利的分类中，B型的风险评分***，其次是C型，***是A型（图7B）。在基因分型中，C基因型的风险评分***，其次是B基因型，***是A基因型（图7C）。这与基于分类的生存分析的先前结果一致，即分类的风险评分越高，预后越差。体细胞突变分布的瀑布图显示，在两个风险组中变化***的十个基因是VHL、PBRM1、TTN、SETD2、BAP1、MTOR、MUC16、KDM5C、DNAH9和LRP2。在高DRG组（图7E）中，***常突变的基因是VHL（42%）、PBRM1（33%）、TTN（16%）、SETD2（16%）、BAP1（12%）和MTOR（10%）。在低DRG组（图7F）中，***常突变的基因是VHL（41%）、PBRM1（39%）和TTN（15%）。同时，高风险组和低风险组之间的肿瘤突变负荷存在统计学上的显著差异，高风险组的肿瘤突变负荷高于低风险组（图7G）。高风险组和低风险组的GSEA富集分析结果显示，高风险组主要富集于补体活性、吞噬识别、免疫球蛋白复合物、免疫球蛋白复合物循环和抗原结合功能（图7D），而低风险组主要富集于剪接体SNRNP组装、剪接体TRI-SNRNP复合物组装、细胞顶部、剪接体SNRNP复合物、剪接体TRI-SNRNP复合物功能（图7H）。GSVA的结果通过热图进行可视化（图7I）。接下来，作者从高风险组和低风险组筛选出差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析，并观察到这些基因在不同的功能和通路中富集。GO结果显示，主要富集在细胞外基质解聚、调节底物依赖性细胞扩展、上皮向间质转化的正向调节、调节性T细胞分化、肌动蛋白-肌球蛋白丝滑动、免疫球蛋白复合物、循环、细胞质囊泡腔、基底膜、基于肌动蛋白的细胞突起群、高密度脂蛋白粒子、硫化合物结合、内切肽酶抑制剂活性、半胱氨酸型内切肽酶调节剂活性参与凋亡过程、赋予拉伸强度的细胞外基质结构成分、磷脂酶A2活性（消耗1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱）功能（图7J）。KEGG结果显示，主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联反应、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、蛋白消化和吸收、阿米巴病、矿物质吸收、类风湿性关节炎、百日咳、胆固醇代谢途径（图7K）。

图7 不同风险组下的聚类结果相关性分析、体细胞变异分析和功能富集分析

8. 基于DRG评分的药物敏感性分析

作者对高风险组和低风险组进行了几种抗癌药物的药物敏感性分析，使用药物的IC50值来表示药物敏感性，并筛选出了许多具有敏感性差异的药物；作者仅选择了六种药物进行演示。高风险组对卡莫司汀、厄洛替尼和吉非替尼更敏感（图8A-C），而低风险组对JAK_8517、索拉非尼和替莫唑胺更敏感（图8D-F）。这些结果表明DRG评分对于药物选择至关重要。

图8 风险群体与药物敏感性之间的相关性分析

9. MSH3可能是肾癌中的一个重要的预后预测标志物

在作者对RCC中五个模型基因的表达进行调查时，作者发现四个基因（MSH3、CRB3、AUP1、RNF10）的表达差异显著（图9A）。相关性弦图显示了这五个模型基因之间的密切关联（图9B）。在对MSH3的研究中，发现随着MSH3的表达增加，其余四个基因的表达也以不同程度发生变化（图9C）。RCC中MSH3的表达被下调（图9D），表达MSH3较低的患者的生存期更糟糕（图9E），ROC曲线显示使用MSH3预测RCC患者预后的准确性较好（图9F）。此外，作者还发现MSH3与RCC患者的临床特征相关。组织学分级较高的患者MSH3的表达较低（图9G），发生转移的患者MSH3的表达较低（图9H），表达MSH3较低的患者的生存期、疾病特异生存期和无进展生存期更糟糕（图9I-K）。

图9 关键基因MSH3对RCC患者的预后有重要影响

接下来，作者分析了MSH3与免疫检查点相关基因之间的相关性，并发现有许多与MSH3相关的免疫检查点基因表达水平（图10A）。作者通过箱线图和棒棒糖图展示了与MSH3相关的免疫微环境浸润景观（图10B、C）。调节性T细胞（Tregs）是肿瘤微环境中常见的免疫细胞，可以抑制免疫反应。它们通过使机体产生对肿瘤细胞的抗原耐受性，促进癌症的发生和发展，从而使肿瘤细胞逃避机体的免疫杀伤作用。MSH3与Tregs之间的相关性分析显示，MSH3的表达水平越低，Tregs的含量越高，预示着预后不良（图10D）。此外，作者对MSH3和NCKAP1进行了Spearman相关性分析，结果显示MSH3与NCKAP1之间存在强正相关（图10E）。根据TCGA数据库的免疫治疗全癌症数据文件，作者使用小提琴图展示了与MSH3相关的免疫治疗情况（图10F、G）。GSEA结果显示，MSH3高表达组主要富集在移植排斥反应中，而MSH3低表达组主要富集在凝血、上皮间质转化、肌肉生成和蛋白质分泌中（图10H）。作者对高低表达水平的MSH3样本进行差异分析，并对获得的差异基因进行功能富集分析。GO分析结果显示，这些差异基因主要富集在体液免疫应答、细胞外基质组织、急性炎症反应、蛋白激活级联、含胶原的细胞外基质、血液微粒子、免疫球蛋白复合物、循环免疫球蛋白复合物、丝氨酸型内切酶抑制剂活性、免疫球蛋白受体结合、肽酶抑制剂活性、受体配体活性功能（图10I）。KEGG分析显示，这些基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、cAMP信号通路、JAK-STAT信号通路、造血细胞系谱、多巴胺能突触、昼夜节律调控、胆固醇代谢、原发性免疫缺陷通路（图10J）。在先前的研究中，NCKAP1是一种名为双硫死亡的新型细胞死亡方式的促进基因，NCKAP1的过表达促进了肿瘤细胞的双硫死亡，从而抑制了肿瘤细胞。综上所述，作者认为MSH3可以成为预测RCC预后的关键标志物，并希望为免疫微环境、免疫治疗、癌症相关功能和通路的研究增添一份贡献。

图10 对与MSH3相关的生物信息学进行***评估

10. 在葡萄糖饥饿条件下，MSH3的过度表达促进了786-O细胞和A498细胞中的双硫死亡

为了进一步验证RCC中MSH3的表达水平，作者检测了人肾皮质近曲小管上皮细胞和RCC细胞系中MSH3的蛋白表达水平。结果显示，RCC细胞系中MSH3的蛋白水平较低（图11A），与作者之前的结论一致。作者成功地在786-O和A498细胞系中过表达了SLC7A11（图11B）。作者转染了MSH3到过表达SLC7A11的细胞中，结果显示MSH3的转染对SLC7A11的表达没有显著影响（图11C）。细胞死亡实验的结果显示，在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下，MSH3的过表达促进了786-O细胞（图11D）和A498细胞（图11E）的细胞死亡。葡萄糖饥饿会耗尽ATP，而葡萄糖饥饿确实会降低RCC细胞的细胞内相对ATP水平。然而，测试过表达MSH3和SLC7A11的RCC细胞的相对ATP水平显示，MSH3的过表达对相对ATP水平没有显著影响（图11F、G），但在葡萄糖饥饿条件下显著促进了细胞死亡。因此，在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下，由MSH3过表达引起的细胞死亡并非由ATP耗竭引起。为了证明在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下，MSH3在RCC细胞中的过表达是否能促进双硫死亡的发生，并排除其他已知的细胞死亡方式的发生。作者使用了多种细胞死亡抑制剂，包括铁死亡抑制剂铁蛋白-1（Ferr-1）和凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）。此外，作者还使用了一种***的二硫键还原剂三（2-羧乙基）磷酸（TCEP）。以上试剂分别用于处理在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下过表达MSH3的RCC细胞。结果显示，Ferr-1和Z-VAD对由MSH3过表达引起的RCC细胞在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下的细胞死亡没有挽救效果，而TCEP完全抑制了由MSH3过表达引起的RCC细胞在葡萄糖饥饿和SLC7A11过表达条件下的细胞死亡（图11H，I）。总结一下，作者的研究结果表明，MSH3的过度表达结合葡萄糖饥饿可以在SLC7A11过度表达的RCC细胞中诱导双硫死亡。

图11 细胞实验表明，MSH3促进了双硫死亡

总结

在这项研究中，作者调查了DRGs对RCC预后的影响，确定了与双硫死亡相关的亚型，并展示了不同亚型的免疫景观。然后，作者基于五个DRGs开发了一种新的预后预测模型，并确认它能够准确预测RCC患者的生存期，展示了与风险评分相关的临床特征、体细胞变异、肿瘤微环境浸润和药物敏感性的差异。***，作者还确定了与RCC患者预后和双硫死亡相关的MSH3基因。总之，作者的研究可能为RCC的亚型和治疗提供新的见解。

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