生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读8+中性粒细胞+分型+单细胞，结合WGCNA和机器学习筛选相关基因，要素丰富，可参考！！单细胞生信

导语

今天给同学们分享一篇中性粒细胞+分型+单细胞的生信文章“Novel insight on marker genes and pathogenic peripheral neutrophil subtypes in acute pancreatitis”，这篇文章于2023年5月16日发表在Front lmmunol 期刊上，影响因子为8.786。

急性胰腺炎是一种全球常见的危重急性胃肠疾病，患病率逐渐增加。然而，外周血基因表达模式尚未完全分析。此外，尚未研究2019冠状病毒病（COVID-19）引起的急性胰腺炎的机制。

1. 鉴定具有显著通路和中心基因的差异表达基因

GSE194331数据集包括了来自AP患者外周血的mRNA表达数据，其中疾病组包括57个轻度胰腺炎样本、20个中度重症胰腺炎样本和10个重度胰腺炎样本，健康对照组包括32个样本。通过DEseq2软件包进行差异表达分析(logFC >1, p < 0.05) (图1A)，共鉴定出1,064个差异表达基因(DEGs) 。如图1B所示，前50个上调和下调基因的转录表达能够区分大部分疾病样本，尤其是重度样本，与健康样本有所区别(图1B)。“中性粒细胞颗粒溶解”是富集术语条形图中的一个显著通路(图1C)。“应激反应”是基因本体分析中***显著的术语(图1D)。这些术语强调了中性粒细胞在AP发生中的关键价值。PPI分析表明存在一些具有显著密度的模块，包括一个包含IL-1R1、IL-1RN、IL-1R2、IL-10和MMP1的模块，一个包含HIST家族基因的模块，以及另一个包含MAPK相关基因的模块(图1E)。IL-10、IL-6、OSM、MMP9、MMP1、LCN2、HGF、TIMP1、IL1B和HIST1H4F被确定为前10个富集基因（图1F、G）。

图1

2. 通过WGCNA鉴定急性胰腺炎中的关键基因模块

为了进一步阐明正常外周血和AP的不同亚型（MAP、MSAP和SAP）之间的潜在机制和基因模块，作者在批次归一化后对两个数据集的疾病样本进行了WGCNA分析（图2A）。如图2B、C所示，所有样本都被纳入分析，***向量幂设置为11。棕色模块和青色模块是与AP严重程度呈负相关和正相关的两个显著基因模块（图2D）。其他基因模块具有紧密的基因调控网络（图5C）。WGCNA的结果表明，棕色模块和青色模块中的基因共同调控AP的生物过程。

图2 WGCNA结果显示急性胰腺炎的不同亚型

3. WGCNA结果显示急性胰腺炎的不同亚型

为了进一步研究已确定模块中的基因功能和重要的KEGG通路，作者使用了Metascape数据库。与T细胞激活和病毒感染相关的“RNA代谢”通路在蓝绿色模块中显著富集。蓝绿色模块的通路网络显示这三个相关通路是独立作用的（图3A）。此外，“中性粒细胞颗粒溶解”，“炎症反应”和“对细菌的反应”在棕色模块中显著富集。蓝绿色模块的通路网络显示这些相关通路是协同作用的（图3B）。

图3

4. 急性胰腺炎中免疫细胞亚型和可靠生物标志物的鉴定

在免疫细胞类型浸润分析中，结果显示随着AP的进展，外周血DCs、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞呈逐渐增加的趋势，而B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg细胞、辅助T细胞（Th细胞）、Th1细胞、Th2细胞和Tfh细胞呈逐渐减少的趋势（图4A）。然后，在重症AP组（MSAP&SAP）和对照组（健康对照组和MAP）之间进行了随机森林分析（图4B）。列出了前30个基因（图4C）。在这些基因中，有10个基因具有显著的诊断价值（AUC >0.8），包括S100A6、S100A9、S100A12、CD63、ITK、CD5、ANXA3、KLF12、TRABD2A和CCR7（图4D）。

图4

5. 验证可靠的生物标志物以监测急性胰腺炎的严重程度

如图5A所示，所有八个基因在健康对照组、MAP组和MSAP&SAP组之间均显示出显著差异。由于检测误差率较低，表达较高的基因更适合作为诊断因子。根据这一标准，筛选出三个具有显著诊断价值的基因（***小相对表达量>500），包括S100A6、S100A9和S100A12。为了测试这些基因在AP严重程度鉴定中的稳定性，收集了28个外周血样本，并检测了这些基因的相对表达量。根据AP的严重程度（MSAP&SAP组和MAP组），在所有基因的表达值中发现了显著差异（图5B）。ROC分析也验证了这些基因在SAP和MAP之间具有显著的诊断价值（图5C）。

图5

6. 急性胰腺炎和COVID-19之间常见生物过程和关键外周血细胞类型的鉴定

为了进一步探索COVID-19引起的胰腺炎中的常见生物过程和关键细胞类型，本研究使用了GSE152418数据集。通过DEseq2软件包鉴定出了1494个差异表达基因。在AP和COVID-19患者的外周血中，共鉴定出161个上调基因和12个下调基因（图6A）。在这些共同基因的KEGG通路分析中，“中性粒细胞去颗粒化”显著富集（图6B）。在网络的中心角色中，发现了“中性粒细胞去颗粒化”通路具有***显著的价值（图6C、D）。

图6

7. 单细胞数据集中中性粒细胞类型的鉴定

正如介绍中所提到的，一项先前的研究表明，COVID-19引起的败血症有可能诱发和加速AP（5-8）。然而，关于细菌引起的败血症，另一种常见的败血症原因，目前没有相关报告。根据作者上面的分析，中性粒细胞可能是COVID-19感染和外周血中AP之间的一个重要亚型共同致病因子。因此，作者接下来通过分析单细胞测序数据来研究细菌引起的败血症和COVID引起的败血症之间中性粒细胞的变化，以确定COVID-19引起的AP的外周血致病因子。如图7A所示，在接下来的步骤中选择0.05作为分辨率。1、6和9组被确定为中性粒细胞（图7B-D）。

图7

8. 不同中性粒细胞类型的鉴定

然后，被鉴定出来的中性粒细胞被筛选并提取进行以下分析。鉴定出了五个中性粒细胞亚群（图8A-C）。如图8D所示，0组在COVID-19组中显著上调，3组在细菌引起的败血症中显著增加。每组筛选出了前10个基因（图8E）。重要的是，0组中的前列基因与IFN反应性表型和炎症有关。3组和4组更有可能表现出增殖表型。中性粒细胞脱颗粒与中性粒细胞的激活密切相关。中性粒细胞脱颗粒的标记基因包括MPO、ELANE、CAMP、CYBA、MMP8和MMP25。如图8F所示，中性粒细胞脱颗粒的标记基因在0组中显著上调。总之，0组代表一种成熟激活的中性粒细胞亚型，主要富集在COVID-19引起的败血症中，具有高表达的IFN相关基因。

图8

9. 零型中性粒细胞是急性胰腺炎相关的潜在致病亚型，与干扰素分泌有关，并在急性胰腺炎患者的外周血中上调

***，在单细胞通路分析的验证后，将0组确定为与干扰素相关的组（图9A、B）。伪时序位点分析显示，5组代表败血症中中性粒细胞的原始和非活化表型，而0组的进化轨迹与其他成熟中性粒细胞不同（图9C、D）。然后，在0组中发现了一些常见的与代谢相关的通路，包括“脂肪酸降解”、“α-亚麻酸代谢”、“硫代谢”和“脂肪酸生物合成”（图9E、F）。***，为了进一步验证已确定的与干扰素相关的中性粒细胞致病亚型，使用cibersoftx软件估计了单细胞测序数据中所有中性粒细胞中已确定亚型的比例，包括AP患者和健康对照组（基于前一个GEO批量测序数据集：GSE194331）。该亚型在健康对照组的外周血中几乎为0，在AP患者的外周血中显著上调，并随着疾病严重程度的增加而增加（图9G）。

图9

总结

总之，作者首次对来自超过87个人类血液样本的测序数据进行了WGCNA分析，将其分为健康组、MAP组、MSAP组和SAP组，并确定了与AP严重程度相关的两个功能基因模块。这是***使用WGCNA在AP的外周血中鉴定基因生物标志物，并通过确定嗜中性粒细胞中的特定功能亚群来提出COVID-19引起胰腺炎的潜在发病机制的研究。这些发现有助于急性胰腺炎的临床严重程度诊断和基础研究