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导语

今天给同学们分享一篇中性粒细胞的生信文章“Integrating Single-cell RNA-seq to construct a Neutrophil prognostic model for predicting immune responses in non-small cell lung cancer”，这篇文章于2022年11月18日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球分布***广泛的肿瘤，其免疫治疗并不实用。中性粒细胞是肿瘤中***丰富的免疫细胞群之一。研究旨在探讨NSCLC肿瘤免疫微环境（TIME）中复杂的通讯网络，阐明免疫细胞与肿瘤之间的相互作用，并通过分析中性粒细胞分化特征建立预测患者免疫反应和预后的预后风险模型。

1. 细胞类型的鉴定

作者将所有细胞分为28个集群，并进一步注释为10种细胞类型：T细胞、B细胞、浆细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮/癌细胞、少突胶质细胞（图1A、B）。接下来，作者分别对淋巴免疫细胞集群（T细胞、B细胞、浆细胞）、骨髓免疫细胞集群（单核细胞、树突状细胞）和上皮/癌细胞进行进一步的亚组聚类。淋巴免疫细胞集群进一步分为14个集群。通过注释确定了七个主要亚群：自然杀伤（NK）细胞、CD4 + T记忆细胞、CD8 + T细胞、B细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、调节性T（Treg）细胞和浆细胞（图1D、E)。随后，骨髓免疫细胞大致进一步分为15个细胞集群。该注释确定了七个主要亚组：单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、浆细胞样树突状细胞、颗粒细胞和中性粒细胞（图1F、G）。对于上皮/癌细胞，作者使用CopyKAT算法来区分正常上皮细胞和癌细胞。然后作者进一步分析正常上皮细胞以获得18个细胞集群。该注释确定了九个主要亚组：基底细胞、肺泡II型细胞、FOXN4 + 细胞、管腔上皮细胞、SLC16A7 + 细胞、离子细胞、朗格汉斯细胞、纤毛细胞和分泌细胞（图1H、I）。28种细胞类型的标记基因表达水平如图1C所示，表明不同的细胞类型有自己特定的标记基因。

图1 单细胞分析：通过降维和聚类得到细胞集群及其Marker

2. TIME网络研究

作者对TCGA队列中的上述28个细胞进行了注释，显示了细胞丰度的比例，发现大多数细胞在正常和肿瘤患者之间存在显着差异（图2A）。有趣的是，患者尤其是肿瘤患者的中性粒细胞含量较高，且明显高于普通患者，这可能与中性粒细胞在肿瘤中的促癌和抑癌特性有关。随后，基于28个细胞集群研究了微环境中的细胞相互作用网络（图2B）。关于免疫检查点，中性粒细胞、NK细胞和单核细胞中高表达的TNFSF14，Treg细胞、颗粒细胞和B细胞中高表达的BTLA，与癌细胞中的LTBR和TNFRSF14相互作用，帮助杀死癌细胞。此外，在癌细胞中高表达的CD24与树突状细胞、巨噬细胞、GMP细胞、B细胞和肥大细胞中的SIGLEC10协同作用，介导肿瘤免疫逃逸。对于细胞因子，CCL5在CD8 + T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD4 + T记忆细胞、浆细胞和朗格汉斯细胞中高表达，并与癌细胞中的SDC1和SDC4强烈相互作用，影响癌症的进展、发展和预后。趋化因子CXCL1、CXCL2和CXCL8在癌细胞中高表达，作用于中性粒细胞中高表达的CXCR1和CXCR2，使中性粒细胞的活性趋化，促进肿瘤免疫微环境的生成。关于生长因子，单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、GMP细胞、巨噬细胞、肺泡II型细胞、SLC16A7 + 细胞、内皮细胞、基底细胞和管腔上皮细胞中的HBEGF与癌细胞表达的高水平CD9相互作用介导肿瘤发生和增殖。作者还发现癌细胞通过血管生成信号分子（VEGFA）与成纤维细胞、内皮细胞、SLC16A7 + 细胞、FOXN4 + 细胞、基底细胞、GMP细胞、单核细胞和NKT细胞中表达的ITGB1相互作用，可能刺激肿瘤生长和转移。

图2 BulkRNA-seq中28种细胞类型的丰度以及scRNA-seq中的细胞相互作用网络

3. 中性粒细胞的不同分化特征

接下来，作者使用Monocle进行中性粒细胞子集的伪时间轨迹分析。结果显示，中性粒细胞分为四种不同的分化状态（图3A和B）。在突变频率前30%的NDRGs（中性粒细胞分化相关基因）中（图3H），发现了7个突变率 ≥ 10%的基因，不同分化状态的NDRGs突变率均在91%以上（图3I）。上述结果表明NDRGs具有高度突变性和异质性，表明NDRGs在影响肿瘤发生和发展的中性粒细胞中发挥着关键作用。随后，对四种状态进行了GSEA（图3C-F）。结果发现，状态一在代谢中显着上调，而在TNF信号通路和细胞凋亡信号通路的调节中呈现下调趋势，表明状态一主要分化与初始状态相关，参与细胞凋亡的发生和发展。状态二在包括肽生物合成过程在内的多个代谢过程中下调，并且在核糖体相关途径中高度下调，表明状态二是完全分化和代谢下调的新状态。状态三与状态二相似，但状态三在中性粒细胞胞外陷阱形成、中性粒细胞趋化性和GTP酶活性方面显着上调，表明状态三参与中性粒细胞趋化性。值得注意的是，状态四在抗原加工和呈递、白细胞激活的正向调节以及信号受体调节活性方面显着上调。与其他状态相比，冠状病毒疾病——COVID-19的活性在状态四时有所增加，表明状态四是产生免疫反应活性的状态，表现为免疫抗肿瘤作用。总体而言，作者发现中性粒细胞分化的四种不同状态及其高致突变性和异质性的NDRG。

图3 中性粒细胞的伪时间分析和NDRG的突变分析

4. 预后风险模型

为了构建预后风险模型，TCGA队列被分为训练集（n = 731）和内部验证集（n = 283），以及GEO队列（n = 80）作为外部验证集。此外，NDRGs和DEGs（图4A）相交（图4B），相交的基因用于构建预后风险模型。首先，作者利用交集基因（ACTB、GAPDH、TFRC、TUBB）建立预后风险模型。然后，使用弹性网络回归算法，确定了八个与预后相关的关键基因（图4C和D）。***，通过多元Cox回归鉴定出6个稳定的重要预后基因（图4E）。采用ROC曲线评价风险评分模型的预后能力，训练集、内部验证集、外部验证集的1年、3年、5年AUC均大于0.6，表明预后风险模型对NSCLC患者的生存具有较强的预测作用。Kaplan-Meier生存曲线显示，按风险评分分组的三个队列之间的生存率存在显着差异（P<0.0001），表明风险评分可以作为患者预后的预测因子（图4F-H）。此外，作者使用预后特征建立了列线图（图4I）。1年、3年和5年生存率的校准曲线表明实际生存率与列线图预测的生存率之间高度重叠（图4J）。这表明列线图具有极好的预测价值。

图4预测风险模型的构建和验证

5. 免疫预测及预后风险模型的临床应用

ssGSEA结果发现，高风险组大部分免疫细胞含量显着低于低风险组，说明低风险组肿瘤微环境中存在更多的免疫成分，也说明低风险组肿瘤微环境中免疫成分较多。高风险组的免疫预后较差（图5A）。随着风险评分增加，免疫细胞组成减少，免疫治疗效果恶化。上述结果表明，预后风险模型参与免疫微环境的调节，可作为预测免疫治疗疗效的指标。在确认了6个预后基因在预测NSCLC患者免疫反应方面的性能后，作者研究了临床特征与风险评分之间的关系。年龄和T分期之间存在显着的统计差异（图5C-H），表明风险评分与年龄和T分期相关。接下来，作者使用单因素Cox回归和多因素Cox回归分析探讨了六种预后基因模型在预测患者结果中的临床应用。单因素Cox结果显示风险评分与预后显着相关（图5I），多因素Cox结果也证明风险评分是NSCLC的独立预后因素（图5J）。这些结果证实了六种预后基因风险模型具有完美的预后效率。

图5 预后模型的免疫预测性能和临床预测能力

6. 探索六个预后基因的功能分析

接下来，作者进一步探讨了六个预后基因的表达、存活和富集通路。首先，对于MS4A7，它在肿瘤中下调，Kaplan-Meier生存曲线表明MS4A7的低表达预示着较差的预后（图6B）。GSVA低表达后的结果表明，各种免疫反应途径的活性，包括免疫受体活性均下调，表明MS4A7参与各种免疫和抗炎反应（图6H）。同样，CXCR2在肿瘤组织中低水平表达（图6A），低表达的CXCR2预后较差（图6D）。CXCR2低表达后，发现细胞因子、细胞钙离子稳态等免疫活性相关通路也呈现下调状态（图6I），表明肿瘤通过降低细胞因子水平来下调部分免疫应激反应。CXCR2的表达以确保其不被免疫细胞杀死。至于LUCAT1，它参与了促进NSCLC发生和发展的多种过程，其在肿瘤中高表达以及高表达后预后较差的证据充分说明了这一点（图6A和C）。此外，在LUCAT1过度表达后，大多数生物代谢途径，包括甘油脂代谢和癌症相关途径，如化学致癌-受体活性途径，显着增加（图6J），这也证明了LUCAT1的促癌作用。

图6 TCGA中六个预后基因的表达水平、生存分析和功能研究

7. 分子对接

在本研究中，作者利用CTD数据库筛选、Autodock分子对接和药物毒理学研究来鉴定针对预后基因的药物。作者发现雌二醇能够与MS4A7紧密结合（图7A）并上调MS4A7mRNA表达，其分子对接的模拟结合能为-4.23（kcal/mol）。雌二醇是女性体内自然产生的内源性循环激素，通常用于治疗与雌激素缺乏相关的疾病。雌二醇过量可引起红细胞数量和子宫重量等变化。分子对接分析的结果表明，在改善CXCR2mRNA表达增加的小分子化合物中，Abrine以-4.58（kcal/mol）的***对接结合能脱颖而出（图7B）。Abrine又名N(α)-甲基-L-色氨酸，是L-色氨酸的N(α)-甲基衍生物，可有效降低色氨酸的分解活性，提高免疫治疗的疗效。目前，除了致死剂量报告外，还没有关于毒性作用的详细信息。Ionomycin可以有效结合RETN并增加其mRNA表达水平（图7C），它们的对接能量为-7.91（kcal/mol）。离子霉素是链霉菌聚合酶产生的具有抗肿瘤活性的钙离子转运蛋白，可增加细胞内钙离子水平并***终导致细胞凋亡。除致死剂量报告外，尚未报告离子霉素的毒性。有趣的是，在寻找增强CSRNP1表达的小分子化合物时，倍氯米松表现出高达−10.97（kcal/mol）的高水平对接结合能（图7D）。倍氯米松是一种典型的糖皮质激素受体激动剂，具有抗炎和抗哮喘作用。除了致死剂量外，没有报告任何毒性作用的详细信息。***，在筛选上调CD177mRNA的小分子化合物时，XL147以其-8.36（kcal/mol）分子对接结合能而脱颖而出（图7E）。XL147和N-亚硝基-三氯乙基脲的组合导致CD177的基因表达增加。XL147是一种磺酰胺，是一种用于癌症治疗的选择性PI3K抑制剂。大于或等于0.1%的XL147成分被国际癌症研究机构认证为非人类致癌物。综上所述，作者筛选出5种有利于改善5种预后基因导致的较差预后的小分子化合物，为NSCLC的靶向治疗提供了新的研究思路。

图7 分子对接

总结

在这项研究中，作者结合了两个大规模的scRNA-seq数据来说明TIME中复杂的细胞通信网络，并表征中性粒细胞的四种分化状态和NDRG。作者能够建立一个预后风险模型，可用于预测患者的预后表现和免疫治疗效果。***，讨论了预后基因引起的不良预后的原因，并筛选了是否存在预后基因的药物，为靶向治疗提供了新的见解。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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