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导语

今天给同学们分享一篇分型+预后模型的生信文章“m7G-related gene NUDT4 as a novel biomarker promoting cancer cell proliferation in lung adenocarcinoma”，这篇文章于2023年1月24日发表在Front Oncol 期刊上，影响因子为5.738。

癌症是癌症患者死亡的主要原因。据报道，N7-甲基鸟苷（m7G）修饰作为一种翻译调节模式参与多种类型的癌症进展，但在癌症中知之甚少。本研究试图探讨m7G相关蛋白在肺腺癌遗传和表观遗传学变异中的作用，及其与临床预后、免疫浸润和免疫治疗的关系。

1. m7G修饰相关基因的遗传改变

遗传改变数据仅在TCGA样本中可用，其中包括477个肿瘤组织样本和54个正常组织样本。m7G修饰相关基因的染色体位置在染色体表意图上可见（图1A）。拷贝数扩增主要发生在AGO2、NSUN2和METTL1基因上，其频率均大于10%。除CYFIP1、EIF4G3和DCPS基因略高于5%外，大多数基因缺失频率均低于5%（图1B）。另一方面，图1C中列出了突变率***的基因，包括EIF4G3（19%）、LARP1（16%）和NSUN2（10%）。单核苷酸多态性是主要的变异类型（图1D）。此外，几乎所有的变异等位基因频率都低于40%（图1E）。大多数SNV是由胞嘧啶脱氧核苷酸突变为鸟嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷酸（图1F），主要是错义突变（图1G）。此外，突变型和野生型患者的存活率分析没有差异（P=0.96）（图1H）。

图1 N7-甲基鸟苷（m7G）修饰相关基因的遗传改变

2. 大多数m7G相关基因与预后不良有关

超过一半的m7G相关基因在肿瘤样本中显著上调，如METTL1、WDR4、EIF4E、LARP1和LSM1（图2A）。在排除了没有存活数据的样本后，共有919个样本留作分析，在整合TCGA和GEO表达数据后，还有18个基因留作存活分析（图2B）。还分析了每个基因之间的相关性，这导致大多数基因彼此呈正相关，但去顶mRNA 2 DCP2与基因METTL1和DCPS呈负相关（图2C）。14个基因与患者的不良预后相关，即WDR4、CYFIP1、DCP2、DIF3D、EIF4E、METTL1、LARP1、EIF4G3、EIF4E2、NCBP1、NCBP2、NUDT4、NUDT11和SNUPN，但NUDT3的高表达与患者的良好生存率有关（图2D）。

图2 N7-甲基鸟苷（m7G）相关基因的表达和存活分析

3. 通过无监督一致性分析将两个子类聚类

图3A所示的热图根据m7G相关基因表达数据将患者分为两组。这些聚类之间的基因比较表明，与聚类A相比，大多数基因在聚类B中高度表达，如CYFIP1、DCP2、EIF3D、EIF4E和WDR4（图3B）。Kaplan–Meier图显示，聚类B的生存率比聚类A差（图3C）。另一方面，进行了用于免疫细胞浸润分析的单个样品GSEA。然后，在方框图中显示了聚类之间免疫浸润的比较结果，这表明大多数类型的免疫细胞的浸润水平在聚类B中下调（图3D）。KEGG途径的GSVA结果如图3E所示，热图显示了富集在亚型B中的途径，包括细胞周期、同源重组、剪接体、核苷酸切除修复和错配修复，而亚型a富集在移植物抗宿主病、转导、IgA产生的肠道免疫网络、哮喘、同种异体移植物排斥反应，自身免疫性甲状腺疾病途径等。此外，m7G亚型之间还比较了预测对CTLA-4和PD-1检查点抑制剂反应性的IPS，这表明亚型A组对所有疗法的反应总是较低（图3F），无论是使用CTLA-4检查点抑制剂还是PD-1检查点抑制剂，还是同时使用两者。

图3 无监督一致性聚类分析

4. 采用Cox回归建立了m7G相关预测模型

共有882个具有临床特征的患者样本被纳入分析。首先，单变量Cox回归分析结果如图4A所示，11个因素是患者的潜在风险因素，即年龄（P=4.63E-05，HR=1.02）、性别（P=0.012，HR=1.28）、T分期（P=1.10E-12，HR=1.60）、N分期（P=7.94E-24，HR=1.84）、EIF3D（P=0.038，HR=1.26）、EIF4E（P=7.21E-05，HR1.54）、NCBP1（P<0.001，HR=1.42）、NCBP 2（P=0.009，HR=1.30），NUDT11（P=0.019，HR=1.13）、NUDT4（P=8.99E-05，HR=1.22）和WDR4（P=0.003，HR=1.30）。然后，将这些风险因素纳入LASSO Cox分析，以优化***拟合模型。系数图显示了使用不同颜色曲线的每个因子系数（图4B），其中基因EIF3D（图中的第五条曲线）和NCBP2（图中第八条曲线）表示较低的系数，交叉验证曲线显示，包含其余九个因子的模型足够有效，可以***限度地减少部分似然偏差（图4C）；因此在以下分析中排除基因EIF3D和NCBP2。***，将其余9个因素纳入多元Cox回归分析，结果通过图4D中的森林图进行可视化。结果表明，年龄、T分期、N分期、NUDT4和WDR4等因素是LUAD患者的独立危险因素。ROC曲线显示，该模型在预测患者生存率方面具有良好的性能，1年、3年和5年生存率的曲线下面积（AUC）分别为0.737、0.736和0.731（图4E）。绘制了生存预测模型的列线图，可用于根据回归模型中的风险因素手动获得预测的风险值（图4F）。风险评分通过多变量Cox分析计算。高危组在逻辑上与不良预后相关（图4G）。另一方面，作者还比较了两个集群之间的风险得分，其中集群B的风险得分高于集群A（图4H）。

图4 N7-甲基鸟苷（m7G）相关基因及临床特征的Cox回归分析

5. 在单细胞分析中还观察到m7G与免疫浸润之间的负相关趋势

共有43025个细胞含有肿瘤细胞（图5A），分析中确定了七种主要细胞类型，即T细胞（n=17420）、单核细胞（n=10690）、B细胞（n=5145）、NK细胞（n=2764）、内皮细胞（n=635）、成纤维细胞（n=961）和上皮细胞（n=5410），不同细胞类型中的前10个标记基因如热图所示（图5B）。11个样本中存在不同的肿瘤浸润水平（图5C），即GS3827125（I期）、GSM3287126（I期，GSM3287127（II期）、GSM3827128（I期、GSM3287219（I期和GSM32827130（I期，使用t-分布随机邻域嵌入t-SNE散点图对每个样本中的所有细胞类型进行可视化（图5D）。在图6A中，不同样本的平均GSVA评分与免疫浸润水平呈负相关趋势，但无统计学意义（R=-0.396，P=0.227）。否则，所有样本的上皮细胞组中几乎都聚集了高GSVA评分（图6B）。作者在Cox回归中分析的独立风险因素也在单细胞数据中进行了分析，NUDT4、NCBP1和WDR4主要在肿瘤细胞中表达（图6C）。另一方面，为了验证TCIA IPS结果，作者分析了T细胞中PD-1的表达（图6D），它也与m7G GSVA评分呈负相关趋势，但没有统计学意义（R=-0.401，P=0.221）（图6E），上皮细胞中PD-L1的表达（图6F）与m7G-GSVA评分呈正相关，但仍无统计学意义（R=0.456，P=0.16）（图6G）。

图5 11例肺腺癌患者样本的单细胞分析和细胞类型鉴定

图6 N7-甲基鸟苷（m7G）GSVA评分与肿瘤免疫浸润细胞的关系

6. NUDT4在本体RNA水平、蛋白质水平和单细胞RNA水平上的表达分析

如上所述，NUDT4是癌症患者的一个独立危险因素（图4D），目前尚无研究探讨其在癌症中的作用。为了进一步证实其在癌症中的潜在作用，作者使用TCGA批量RNA数据和GEO数据集分析了其表达水平。然而，在LUAD或鳞状癌症亚型中，肿瘤和正常组织之间没有差异（图7A，B）。但当作者比较免疫化学结果时，发现NUDT4在肿瘤芯片中的表达高于正常组织芯片（图7C、D）。因此，为了更具体地了解其在癌症和正常细胞之间的表达，作者整合了肿瘤和正常单细胞RNA数据（图8A，B），并打算选择上皮细胞进行分析（图8C）。在具有NUDT4表达的七种细胞类型中，肿瘤和正常样本之间的上皮细胞存在显著差异（图8D），但在不同的患者中有所不同（图8E）。在配对患者的样本中，NUDT4在6名患者的肿瘤上皮细胞中高表达（图8F）。

图7 NUDT4在本体RNA水平和蛋白质水平上的表达

图8 NUDT4在单细胞RNA水平上的表达

7. NUDT4参与肿瘤细胞增殖，但不参与迁移

然后，为了探索其在肿瘤细胞中的功能，作者设计了shRNA、sgRNA和过表达质粒来敲低、敲除或过表达NUDT4的表达。然而，在***次期间，NUDT4的表达被敲低，但细胞不能被扩增并用于以下实验。因此，作者将shRNA序列克隆到Tet-on系统质粒中（图9A），当构建稳定的细胞系时，使用多西环素诱导细胞shRNA表达，然后通过RT-qPCR验证敲除效率（图9B）。在A549和H1299细胞中均观察到NUDT4敲低抑制细胞增殖（图9C）。但组之间的迁移能力似乎没有差异（图9D、E）

图9 肺腺癌细胞系中的NUDT4功能验证

为了进一步验证NUDT4 DNA水平的结果，作者还设计了sgRNA，试图敲除NUDT4外显子。通过TIDE分析敲除效率(https://tide.nki.nl/)，这表明只有sgRNA1在H1299细胞系中有效（敲除效率=52.3%，图9F），但在A549细胞系中不起作用（敲除率=19.3%，图9I）。还测定了细胞增殖和迁移能力，与shRNA相比显示出相似的结果（图9G–K）。另一方面，作者还将NUDT4mRNA克隆到A549和H1299细胞系中以过表达NUDT4，并进行RT-qPCR以验证过表达效率（图10A，C）。然后，进行CCK8测定（图10B，D）和Transwell测定来观察细胞功能，这表明NUDT4的过表达促进了两种细胞系中的细胞增殖能力，但肿瘤细胞的迁移能力仍然没有受到影响（图10E，F）。

图10 NUDT4在肺腺癌细胞系中的高表达

总结

总之，通过对三种不同类型数据集的综合分析，作者的研究分析了LUAD中的m7G相关基因，并将其与临床特征和免疫浸润相关联。作者还构建了一个基于m7G基因和风险评分的预后模型，用于预测患者的生存结果。另一方面，作者发现NUDT4可能是抑制肿瘤细胞增殖的新靶点。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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