生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读***4+单基因+单细胞生信思路！可借鉴可升级！！单基因生信

导语

今天给同学们分享一篇单细胞+单基因的生信文章“ACSL4 serves as a novel prognostic biomarker correlated with immune infiltration in Cholangiocarcinoma”，这篇文章于2023年5月16日发表在BMC Cancer期刊上，影响因子为4.638。

胆管癌（CHOL）是继肝细胞癌（HCC）之后第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤。CHOL具有高度侵袭性和异质性，导致预后不良。CHOL的诊断和预后在过去十年中没有改善。据报道，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）与肿瘤有关，但其在CHOL中的作用尚未揭示。本研究主要探讨ACSL4在CHOL中的预后价值和潜在功能。

1. ACSL4在CHOL中的表达上调

作者使用TIMER2.0来探索各种癌症中正常组织和肿瘤组织之间ACSL4的不同表达（图1A）。结果表明，ACSL4在胆管癌（CHOL）、结肠癌、头颈部癌症、胃癌中水平升高。此外，作者用TCGA-CHOL、GSE76297和GSE107943数据库验证了ACSL4在CHOL中的表达水平上调（图1B-D）。qPCR用于检测ACSL4在作者的CHOL患者组织和配对邻近组织中的表达，作者发现ACSL4蛋白（图1E）和mRNA水平（图1F）在CHOL组织中高于配对邻近组织。HPA数据库中CHOL组织和正常肝组织中ACSL4的IHC染色也证实了这一结果（图1G）。上述数据表明，在CHOL组织中ACSL4增加。

图1 ACSL4在CHOL中的表达上调

2. CHOL患者ACSL4表达增加与预后不良相关

为了研究ACSL4与CHOL预后之间的相关性，TCGA和GSE107943数据集中的患者根据ACSL4水平分别分为高ACSL4组和低ACSL4组。Kaplan-Meier分析显示，ACSL4高表达患者的总生存率（OS）较差（P = 0.0342，图2A）和无进展间期（PFI）（P = 0.4875，图2B）在TCGA数据库中，但PFI没有统计学意义。ROC分析的AUC用于测量ACSL4在CHOL中的诊断价值（AUC = 0.889，P < 0.001，图2C）。在GSE107943中发现了类似的结果（图2D-F）。此外，作者将TCGA-CHOL和GSE107943数据集合并为一个数据集，然后通过“sva”包去除批量效应。在新的数据集中，ACSL4高表达组也意味着令人沮丧的总体预后（P = 0.0160，图2G），1年、2年和3年的ROC曲线的AUC分别为0.54、0.68和0.78（图2H）。此外，在作者的40名CHOL患者中，高ACSL4表达也意味着低OS（P = 0.0136，图2I）。CA19-9是CHOL诊断中***广泛使用的肿瘤标志物，在高ACSL4表达组中更高，尽管P值没有统计学意义。因此，ACSL4水平可用于预测CHOL患者的长期生存率。

图2 CHOL患者ACSL4 mRNA表达增加与总生存率低相关

3. ACSL4与CHOL免疫浸润的关系

近年来，许多研究表明，免疫浸润在肿瘤进展中起着关键作用。因此，TIMER2.0用于评估CHOL中ACSL4表达与免疫细胞浸润之间的相关性。结果表明，ACSL4与中性粒细胞、CD4 + T细胞，癌症相关成纤维细胞、巨噬细胞M1、M2巨噬细胞和普通淋巴祖细胞的浸润程度有关（图3A-B）。然后，作者研究了ACSL4的表达与TISDB数据库中各种免疫特征之间的相关性。作者发现ACSL4的表达与CHOL中的趋化因子和趋化因子受体显著相关，包括CXCL8、CXCL12、CXCL14、CXCL16、CXCR1（图3C-G）。同时，作者发现ACSL4的表达也与CHOL中的免疫刺激剂和免疫抑制剂相关，包括TNFS4、TNFRSF14、TGFBR1、CD160（图3H-K）。因此，证实了ACSL4可能作为一种免疫调节因子来调节CHOL中的免疫浸润。

图3 ACSL4与CHOL中免疫浸润表达的相关性

4. CHOL中ACSL4表达与TIL的关系

肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）是包括CHOL在内的各种癌症发展的独立因素。CIBERSORT用于研究CHOL中22个免疫细胞的比例。作者发现M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、活性NK细胞、静息CD4细胞的水平 + 记忆性T细胞和CD8 + CHOL中的T细胞正在增加（图4A-B）。然后，将来自TCGA和GSE107943的样品分为ACSL4高表达组和低表达组。中性粒细胞和CD8的比例 + 细胞在高ACSL4表达组中上调。相反，记忆B细胞、M0巨噬细胞和γδT细胞在低ACSL4表达组中上调（图4C）。

图4 CHOL中ACSL4表达与TIL的关系

5. 通过单细胞分析检测ACSL4在CHOL中的表达和细胞

作者分析了GSE138709，以检测ACSL4表达与细胞之间的相关性。根据标记基因表达，将细胞群分为15组，并将15个簇合并为8个细胞群，即T细胞（CD3D）、恶性肿瘤（KRT19）、肝细胞（ASGR1）、胆管细胞（FXYD2）、单核细胞（CD68）、内皮细胞（FCN3）、成纤维细胞（ACTA2）和B细胞（CD79A）（图5A-B）。结果表明，ACSL4可以在所有8种类型的细胞中表达，尤其是在单核细胞中（图5C-E）。与正常样本相比，ACSL4的表达主要在CHOL样本中的恶性肿瘤、T细胞和胆管细胞中上调。

图5 通过单细胞分析检测ACSL4在CHOL中的表达和细胞

6. ACSL4在CHOL中的共表达网络和潜在功能

为了研究ACSL4在CHOL中的潜在功能和机制，应用连接组学分析了ACSL4的共表达网络。作者发现192个基因与ACSL4呈正相关，114个基因与ACS L4负相关（P < 0.01，图6A）。热图显示前50个基因与CHOL中的ACSL4呈正相关和负相关（图6B-C）。接下来，在ACSL4共表达基因中分析了KEGG和GO分析（P < 0.05）。结果表明，ACSL4共表达基因在蛋白质消化和吸收、HIF-1信号通路和碳代谢方面富集。正如作者所预期的，铁死亡与ACSL4共表达基因有关，作者进一步证明ACSL4参与了CHOL铁死亡的进展（图6D）。ACSL4共表达基因可能参与泛素样蛋白连接酶结合、含有胶原的细胞外基质、外部包封结构组织和GO通路中的其他过程（图6E）。这些结果表明，ACSL4的共表达基因可能主要参与CHOL的代谢相关通路。

图6 共表达网络和ACSL4在CHOL中的潜在功能

7. 敲除ACSL4可以显著抑制CHOL的增殖和迁移

基于ACSL4在CHOL肿瘤进展中具有潜在作用的临床证据，作者分析了ACSL4对BEC和4种CHOL细胞系的表达（图7A）。作者接下来选择RBE和HuCCT1细胞进行siRNA介导的敲除实验，因为表达上调***。ACSL4 siRNA的功效通过qPCR和Western印迹得到证实（图7B-C）。然后，用CCK8、EdU和克隆形成测定法测量细胞活力。结果表明，敲低ACSL4抑制了CHOL的增殖（图7D-F），并通过transwell和伤口愈合测定持续降低了迁移能力（图7G-H）。这些结果表明，敲低ACSL4可以抑制胆管癌的增殖和迁移。

图7 敲除ACSL4可以显著抑制CHOL的增殖和迁移

总结

总之，本研究是首次探索ACSL4在CHOL中的作用。CHOL中ACSL4水平升高。ACSL4的高表达与预后不良一致，ACSL4在CHOL中具有重要的诊断价值。此外，作者发现ACSL4与CHOL中的免疫浸润和TIL有关，并通过单细胞分析探讨了ACSL4在CHOL中表达。此外，作者还研究了ACSL4及其共表达基因在CHOL中的潜在功能。在体外，作者验证了ACSL4可以通过敲低ACSL4来促进CHOL的发展。这些发现表明ACSL4可能是CHOL抗癌策略的潜在靶点，鼓励进一步研究以确定ACSL4调节CHOL发展的具体机制。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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