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导语

今天给同学们分享一篇非肿瘤+人工神经网络的生信文章“An artificial neural network model to diagnose non-obstructive azoospermia based on RNA-binding protein-related genes”，这篇文章于2023年4月24日发表在Aging (Albany NY)期刊上，影响因子为5.955。

非梗阻性无精子症（NOA）是一种严重的男性不育，但其病理机制和诊断生物标志物尚不清楚。由于RNA结合蛋白（RBPs）的失调对精子发生具有不可忽视的影响，作者旨在研究RBPs在NOA中的功能和诊断价值。

1. 51种RBPs在对照和NOA样品之间有差异表达

流程示意图如图1所示，以图形方式描述了这项研究的方法。首先，作者比较了从先前研究中收集的1542个RBPs在GSE9210队列中对照和NOA病例睾丸样本中的mRNA表达水平。结果表明，1542个RBP中有51个差异表达，如火山图（图2A）和热图（图2B）所示。功能注释显示，51个差异表达基因（DEG）主要参与翻译调节、RNA代谢、RNA稳定性调节和精子发生过程，这表明RBPs在NOA的发病机制中具有巨大作用（图2C）。

图1 本研究的工作流程

图2 51种差异表达的RBPs及其功能富集

2. PPI网络建设

作者构建了PPI网络，以进一步探索51个DEG在蛋白质水平上的内部接触和相互作用。图3A说明了已建立的PPI网络，其中节点的大小表示GSE9210队列中相应logFC的***值。将网络中基因的重要性和影响量化为程度，并确定和选择程度***的前20个基因进行下一步研究（图3B）。

图3 51个RBP的PPI网络分析

3. 通过特征选择算法和PPI网络分析识别DDX20和NCBP2

通过LASSO回归，5个基因被鉴定为NOA的重要特征（图4A），包括NCBP2、DDX20、TSN、SRPK2和CARHSP1。LASSO回归模型中这些基因的系数分别为−0.121、−0.703、−0.770、−0.921和−0.178（图4B）。同时，通过Boruta算法从51个DEG中选择30个（图4C），并通过SVM-RFE筛选6个基因，包括NCBP2、DDX20、CCDC86、TSN、CARHSP1和TDRD7（图4D）。***终，通过整合PPI网络中具有***程度的前20个基因和这些特征选择结果来识别NCBP2和DDX20（图4E），然后将其纳入诊断模型构建。

图4 通过特征选择方法和PPI网络分析确定了DDX20和NCBP2

4. DDX20和NCBP2的外部验证

432个睾丸细胞样本的scRNA-seq数据表明，DDX20（标称P<0.001，FDR<0.001）和NCBP2（标称P<0.01，FDR=0.05）均与精子发生过程呈正相关（图5A），再次证实DDX20和NCBP1是NOA的重要生物标志物。接下来，作者从当地医院收集了27名对照组和17名NOA患者的精浆和睾丸活检，以进行验证。与对照样品相比，NOA样品精浆中DDX20（P<0.01，图5B）和NCBP2（P<0.05，图5C）的mRNA水平较低，这表明精浆中的DDX20和NCBP1水平也是NOA有希望的诊断生物标志物。ROC分析显示，精浆中的DDX20是NOA的有力分类器（曲线下面积[AUC]=0.826，95%置信区间[CI]=0.706–0.946，图5D），而NCBP2的预测性能相对较低（AUC=0.693，95%CI=0.534–0.852，图5D），这可能是由不同队列的异质性引起的。因此，作者随后使用IHC染色研究了本地队列中DDX20的蛋白质水平，结果支持了之前得出的结论，即DDX20在NOA睾丸样本中显著下调（P<0.05，图5E）。

图5 DDX20和NCBP2的外部验证

5. LR、RF和ANN诊断模型的性能

本研究利用多个数据集，包括GSE9210、GSE45885、GSE45.87和GSE145467，以及本地临床样本来验证所建立模型的预测能力。需要说明的是，作者使用精浆（而不是睾丸样本）中的mRNA表达值来验证本地队列中的模型，因为根据我院伦理委员会制定的政策，无法获得新鲜的睾丸样本。由于作者已经检测到DDX20和NCBP2在精浆中的表达，并发现这两个基因在NOA样本中都被下调，这与训练数据集中的结果相对应，作者认为在来自本地队列的精浆样本中的验证仍然是可以接受的。

首先，构建了LR诊断模型，其中EXP表示基因的mRNA表达值。LR模型在训练队列中的预测能力相当高（AUC=0.955，95%CI=0.865–1.000，图6A）。然而，它在GSE45885队列（AUC=0.514，95%CI=0.256–0.772，图6B）和GSE45887队列（AUC=0.531，95%CI=0.267–0.795，图6C）中的表现并不理想。GSE145467和局部队列中LR模型的AUC分别为0.700（95%CI=0.493–0.907，图6D）和0.597（95%CI=0.465–0.729，图6E）。这些队列中LR模型的混淆矩阵分别如图6F–6J所示。一般来说，LR模型的预测能力远不能令人满意，尤其是在外部验证队列中，这启发了作者利用更多的工具来构建诊断模型。

图6 LR诊断模型在每个队列中的预测性能

随后，作者建立了一个RF模型来对NOA样本进行分类。RF模型在训练数据集（AUC=1.000，95%CI=1.000–1.000，图7A）、GSE45885数据集（AUC=0.6776，95%CI=0.385–0.967，图7B）、GSE4 5887数据集（AUC=0.656，0.381–0.932，图7C）、GSE145467数据集（AOC=0.750，95%CI=0.562–0.938，图7D）和局部队列（AUC=0.656，95%CI=0.547–0.765，图7E）中显示出优于常规LR模型的优势。图7F–7J表示每个队列中RF模型的混淆矩阵。

图7 射频诊断模型在每个队列中的预测性能

人工神经网络也是一种广泛使用的诊断模型建立方法，已经提出了许多人工神经网络诊断模型，并在多种疾病中表现出高可靠性和准确性。因此，作者基于NOA中DDX20和NCBP2的表达开发了一个ANN诊断模型，如图8A所示。与之前的贡献类似，已建立的ANN模型在训练队列中显示出较高的预测性能，图8G-8K显示了这些队列的混淆矩阵。ANN模型在局部队列中的表现并不令人满意（AUC<0.7），但考虑到不同的样本类型和基因表达检测方法，作者认为结果仍然可以接受。总的来说，在不同队列之间高度异质性的背景下，人工神经网络模型是一种很有前途的对NOA样本进行分类的工具。

图8 人工神经网络诊断模型的建立与验证

在这里，作者主要从AUC方面来衡量这些模型的预测性能。然而，其他评估指标，包括准确性、精密度、召回率、F-测量、敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，也提供了参考。

6. DDX20和NCBP2相关基因的功能

图9A和9B分别显示了与DDX20和NCBP2连接***的前20个基因及其相互作用模式。DDX20相关基因主要涉及细胞转录、RNA修饰、RNA剪接、RNA定位和RNA稳定性维持（图9C）。NCBP2相关基因主要富集于mRNA和miRNA处理、RNA稳定性调节和DNA修复（图9D）。这些数据揭示了进一步阐明DDX20和NCBP2的生物学功能的线索。