生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读8+失巢凋亡+分型+风险模型+泛癌生信思路，多热点联合分析=永不撞车+高分保证√肿瘤生信

导语

今天给同学们分享一篇失巢凋亡相关的生信文章“Identification and validation of an anoikis-associated gene signature to predict clinical character, stemness, IDH mutation, and immune filtration in glioblastoma”，这篇文章于2022年8月25日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。

胶质母细胞瘤（GBM）是成人***突出和***侵袭性的原发性脑肿瘤。失活是一种特定形式的程序性细胞死亡，在肿瘤侵袭和转移中起着关键作用。抗失巢因子的存在与肿瘤的侵袭性和耐药性有关。

1. GBM失巢凋亡相关基因的遗传变异和表达

本研究共包括27个失巢凋亡相关基因。使用网络图可视化了失巢凋亡相关基因与GBM预后价值之间复杂关系的综合景观（图1A）。作者研究了GBM中27个失巢凋亡相关基因的体细胞突变发生率。其中，PIK3CA的突变率***（高达8%），而其他基因的突变率相对较低（图1B）。失巢凋亡相关基因的CNV改变在染色体上可见，如图1C所示。此外，对27个失巢凋亡相关基因的研究表明，CNV相关突变普遍存在。PIK3CA、NOTCH1、STK11、MCL1和PTRH2表现出广泛的CNV扩增，而ITGA5、MTOR、CEACAM5、CHEK2、CAV1、TLE1、BRMS、CEACAM6、MAP3K7和BCL2表现出CNV缺失（图1D）。与正常组织相比，大多数失巢凋亡相关基因在GBM组织中显著上调。此外，作者发现27个失巢凋亡相关基因的表达在GBM的CL、MES和PN亚型之间存在显著差异（图1E）。在作者探索27个失巢凋亡相关基因对综合GEO数据集总生存期（OS）的影响时，作者发现PTK2、PIK3CA、PDK4、NTRK2和ITGA5的表达与GBM患者的OS在统计学上相关（图1F）。

图1 GBM失巢凋亡相关基因的遗传变异和表达

2. PTK2和ITGA5在临床肿瘤组织中表达的验证

鉴于单因素Cox回归分析的结果表明，PTK2和ITGA5分别是GBM患者预后的有利因素和危险因素，作者进一步对PTK2和ITCA5进行了GSEA，以验证它们的基因功能。基于合并GEO数据集的GSEA显示，细胞凋亡、JAK STAT信号传导、上皮细胞间质转移和血管生成功能途径分别在ITGA5高表达组和PTK2低表达组中富集。在TCGA数据集的基础上获得了类似的GSEA结果。

采用免疫组织化学（IHC）染色法检测在山东大学第二医院接受治疗的患者的胶质瘤和瘤周组织中具有代表性的PTK2和ITGA5蛋白水平。与先前的结果一致，与瘤周组织相比，神经胶质瘤中的ITGA5蛋白水平显著升高，而肿瘤中的PTK2水平降低（图2A、B）。

图2 PTK2和ITGA5在临床肿瘤组织中表达的验证

3. 失巢凋亡与TME、干性和临床特征的相关性

作者使用NMF算法将650名GBM患者分为两类，称为C1和C2（图3A）。热图显示了失巢凋亡相关基因在C1和C2中的详细表达（图3B）。Kaplan–Meier（KM）分析结果显示，C1和C2集群之间的患者生存率存在差异（p=0.026）（图3C）。关于两个集群之间的TME差异，作者观察到C1在几种免疫细胞浸润中显著丰富，如调节性T细胞、CD8 T细胞、活化的NK细胞、树突状细胞和其他细胞（图3D）。此外，分析了失巢凋亡相关基因对GBM肿瘤中免疫相关细胞表达的调节作用，如图S4A所示。在干性指数分析中，C2的mRNAsi和EREG mRNAsi更接近1，这表明C2中的GBM与干细胞具有高度相似性（图3E）。然而，一些研究表明，较高的指标似乎与多种类型癌症的进展程度和不良预后直接相关，因此需要进一步研究。在桑基图中，作者确定了C1和C2亚型与临床分型之间的相互关系，具有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛甲基化子表型（G-CIMP）的GBM患者主要集中在C2（图3F）。作者评估了GBM肿瘤组织中的TME。趋化因子、免疫抑制剂和免疫刺激因子在C1中的表达更为显著（图S3B）。KEGG分析显示，C2中以下通路显著激活：癌症、凋亡、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号途径等。有趣的是，Wnt信号通路在C1中更为活跃（图3G）。此外，GO分析显示，C1中的失巢凋亡相关基因在以下功能组中显著富集：toll样受体3信号通路、对肿瘤坏死因子的反应、T细胞介导的免疫等（图3H）。

图3 失巢凋亡与TME、干性和临床特征的相关性

4. 风险评分的构建和验证

为了获得与临床特征***相关的关键模块，作者对合并的GBM数据集进行了WGCNA（图4A）。作者总共获得了897个与失巢凋亡相关的差异基因，并***终确定了共表达模块。根据模块-性状关系的热图，blue和green模块与临床性状的相关性***（图4B）。进行单因素Cox回归算法，初步获得524个与GBM预后相关的基因，并计算失巢凋亡相关基因的HR和P值。结果如图4C所示。接下来，作者试图使用LASSO算法来识别GBM的预后基因集，并***终找到了9个基因集（图4D，E）。***，使用9个用于预测GBM患者生存和预后的失巢凋亡相关基因来构建风险评分（图4F）。

图4 风险评分的构建和验证

作者对GlioVies GBM患者队列进行了系统随机分组，以区分训练集（n=411）和测试集（n=174）。KM分析显示，训练集和测试集的风险得分越高，生存率越低（P<0.0001）（图4G）。利用ROC和DCA来评估模型对预后的敏感性和特异性。根据ROC曲线下面积（AUC）对结果进行评估。训练集的1、2、3和5年AUC分别为0.661、0.773、0.780和0.845，测试集的AUC分别是0.691、0.728、0.694和0.636（图4H）。作者还验证了ROC预测GBM患者预后的准确性（图4I）。使用多变量Cox回归分析来评估临床特征（性别、CIMP状态和亚型）和风险评分是否是GBM患者的独立预后因素。作者发现，在训练集和测试集中，年龄和风险评分是GBM患者的独立预后因素。

5. GBM中基于风险评分的列线图

混合列线图稳定、准确，可用于GBM患者的临床管理。作者基于高风险和低风险评分模型建立了一个列线图，能够预测GBM在1年、2年、3年和5年的生存概率（图5A）。列线图也被纳入时间相关ROC中，以预测GBM患者的生存时间。训练集的1、2、3和5年AUC分别为0.685、0.806、0.800和0.833，测试集的AUC分别是0.723、0.787、0.784和0.761（图5B）。ROC的验证和评估如图5C所示，风险因素的DCA如图5D所示。

图5 GBM中基于风险评分的列线图

关于高风险评分和低风险评分之间TME浸润的差异，作者观察到低风险评分组中的几种免疫相关因素非常丰富（图5E）。关于免疫检查点，CD40LG、CD8A、JKA1、LDHB和其他在风险评分较低的患者中更明显地高表达，IL12A、LDHA、LDHC、TNFRSF4和YTHDF1在风险评分较高的患者中显著表达（图5F）。风险评分较低的患者的mRNAsi和EREG mRNAsi更接近1，这表明风险评分较轻的GBM患者与风险评分较高的GBM相比差异较小（图5G）；这一发现需要更多的研究。在分析风险评分模型与GBM不同亚组患者之间的关系时，Wilcoxon检验显示C1和C2之间的风险评分存在明显差异。此外，C2的风险评分中位数低于C1。此外，作者发现G-CIMP和非G-CIMP组之间以及PN和MES GBM亚型之间的风险评分存在明显差异（图5H）。

6. 基于TCGA数据集的风险评分验证

作者基于综合GEO队列构建了风险评分，并分析了风险评分与临床特征之间的相关性（图6A）。作者进一步验证了基于使用从TCGA数据集获得的样本生成的相同算法的风险评分模型。作者基于生存分析验证了基于差异表达失巢凋亡相关基因的风险评分，作者还发现KM分析显示，高风险基因的表达与较差的生存率相对应（图6B）。高风险组和低风险组GBM患者不同临床预后因素的权重百分比如图6C所示。此外，作者比较了男性和女性的风险评分，结果显示男性和女性之间的风险评分没有显著差异。然而，年龄>60岁的GBM患者的风险评分明显高于年龄<60岁的患者。作者用AUC说明了ROC的结果。风险评分的0.5年、1年和2年AUC分别为0.560、0.617和0.651，在预测GBM预后方面表现出优于传统临床病理特征的表现。作者还验证了基于风险评分的ROC预测GBM患者预后的准确性（图6D）。然后，对AUC和ROC的准确性进行分析，作者根据风险评分开发了一个列线图（图6E）。此外，作者使用map工具包分别评估了高风险和低风险患者中出现的肿瘤体细胞突变。结果显示，低分组比高分组表现出更广泛的TMB。此外，在低风险组中很少观察到几个基因的体细胞突变，如TP53，但在高风险组中经常观察到。TP53是一种肿瘤抑制基因，调节细胞分裂和增殖。许多研究表明，TP53基因的突变与多种人类肿瘤的发展有关。作者进一步验证了基于CGGA队列的风险评分模型。结果与之前的分析相似。GBM高危评分组患者的生存时间较短。此外，CGGA GBM的时间-ROC和校准曲线也在图S5E、F中可视化。

图6 基于TCGA数据集的风险评分

7. 风险评分模型的泛癌分析

作者进行了泛癌分析，以评估不同癌症之间风险评分模型的相似性和差异性。作者系统地分析了TMB、MSI和CD274在癌症中的表达。BRCA、CESC、COAB、ESCA、HNSC、LGG、LUAD、PRAD、STAD和THCA的风险评分与TMB呈正相关（P<0.05），而KIRC和LAML的风险评分则与TMB呈负相关（P<0.05）。此外，风险评分与ACC、LGG、PCPG、PRAD、SKCM、TGCT和THCA中CD274的表达呈正相关，与BRCA、ESCA、KIRP、LAML、LUAD和PAAD中CD274含量呈负相关。此外，作者计算了风险评分与22个免疫细胞浸润和干性指数之间的相关性。结果如图7A–C所示。

图7 风险评分模型的泛癌分析

8. 风险评分与免疫治疗反应和药物敏感性的相关性

为了评估风险评分对预测免疫治疗敏感性的影响，作者纳入了一个晚期尿路上皮癌免疫治疗队列（IMvigor210队列）。对数秩检验表明，风险评分较高的患者生存时间较差（图8A）。免疫检查点阻断（ICB）通过阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用发挥作用，从而减轻肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。作者评估了风险评分在预测免疫疗法反应方面的价值。作者观察到，在ICB治疗研究中，风险评分较低的患者表现出更好的治疗效果，并得出结论，与低风险评分组相比，高风险评分组的反应组（CR和PR）患者比例显著较低。然而，无/有限反应组（SD和PD）中的患者比例显示出相反的趋势，表明风险评分可以揭示患者对ICB治疗的反应（图8B）。关于高风险组和低风险组与免疫表型之间的关系，沙漠现象在高风险组更为明显，而在低风险组观察到更多的炎症（图8C）。通过分析风险评分与肿瘤新抗原负荷之间的关系，作者观察到风险评分较低、新抗原负荷较高的患者生存时间***长。此外，风险评分较高、新抗原负荷较低的患者生存时间***短（图8D）。

图8 风险评分与免疫疗法反应和药物敏感性之间的关系

评估风险评分在预测多种癌症药物敏感性方面的价值。根据Spearman相关性分析，作者在GDSC数据库中选择了31种风险评分和药物敏感性显著相关的药物。风险评分对五种药物呈负敏感，包括奥替溴铵、雷帕霉素、AZD5991、沙布托克拉和AGI-6780，并与26种药物的敏感性呈正相关，包括CZC24832、5-氟尿嘧啶、AZD8186、GSK343和其他药物（图8E）。其中，CZC24832表现出***强的药物敏感性。研究表明，CZC24832对药物PI3Kγ的抑制显著损害了CLL细胞的迁移。此外，作者还探索了所选药物靶向的信号通路。作者发现，基于PI3K/mTOR、IGF1R、基因组完整性和EGFR信号传导的药物敏感性和风险评分之间的关系是积极的。相反，敏感性与风险评分呈负相关的药物靶向代谢和细胞凋亡调节信号通路（图8F）。总之，风险评分的建立将有助于探索正确有效的治疗策略。

总结

在这项研究中，作者基于27个失巢凋亡相关基因系统地生成并评估了GBMs的风险评分，并将这些模式与TME联系起来。风险评分模型用于预测患者的预后和对免疫疗法的反应。风险评分的系统评估可以扩大作者对侵袭的理解，并有助于开发更个性化和***的治疗策略。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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