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导语

今天给同学们分享一篇机器学习+实验的生信文章“Identification of m6a-related signature genes in esophageal squamous cell carcinoma by machine learning method”，这篇文章于2023年1月17日发表在Front Genet期刊上，影响因子为4.772。

作者旨在通过机器学习构建和验证食管鳞状细胞癌（ESCC）相关的m6A调节因子。

1. m6A RNA甲基化调节因子在食管鳞状细胞癌中的表达

作者使用从四川大学华西医院胸外科收集的66个ESCC样本的转录组数据来分析m6A RNA甲基化调节因子的mRNA表达水平。生成热图以可视化21种m6A调节因子的表达，这些调节因子在ESCC和正常组织之间存在显著差异（图1A）。与正常组织相比，ESCC中18种m6A调节因子（METTL3、METTL16、WTAP、VIRMA、RBM15、CBLL1、YTHDF1、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGFBP3、RBMX1、ELAV1、IGF2BP1、FTO和ALKBH5）的mRNA表达水平显著增加。其他3种调节因子（RBM15B、YTHDC1、YTHDC2）在ESCC中下调（图1B）。然后，作者使用来自TCGA-ESCA数据库的转录组数据，使用相同的方法分析m6A RNA甲基化调节因子的mRNA表达水平。类似地，作者发现7种m6A调节因子（YTHDF1、HNRNPC、FMR1、HNRNPA2B1、IGFBP3、ELAVL1和IGF2BP1）的mRNA表达在ESCC中与正常组织相比显著上调，而METTL3、RBM15B、YTHDC2和IGFBP2在ESCC显著下调。

图1 RNA-seq数据和TCGA-ESCA数据中不同m6A RNA甲基化调节因子的表达

2. 利用机器学习筛选食管鳞状细胞癌相关的m6A调节因子

作者首先对我院的转录组数据使用了RF（随机森林）和SVM（支持向量机）机器学习方法，将上述21个m6A基因的表达作为自变量，将正常组和ESCC组作为结果变量纳入RF和SVM模型。作者分析了两个模型的箱线图和累积残差分布，以确定哪一个模型具有更好的性能。图2A显示，RF的平均残差值为.00467，SVM为.00471。RF的残差逆累积分布线大部分位于SVM的残差线内（图2B），表明RF的预测值与真实值之间的差异较小，模型更准确。因此，作者选择RF模型来预测ESCC相关的m6A基因。从图2C中可以看出，ESCC组误差（红色）、正常组误差（绿色）和总样本误差（黑色）的交叉验证***小误差点为.076，对应于233个***随机森林树。通过RF模型进一步获得ESCC相关m6A基因的重要性评分。Gini评分平均值越高，该基因就越重要。***，作者得出IGFBP3、HNRNPA2B1、YTHDF1、YTHDC1、HNRNPC、YTHDF3、WTAP、FTO和RBM15是与ESCC显著相关的m6A调节因子（图2D）。同样，作者将从TCGA-ESCA数据库中筛选出的上述11种m6A调节因子导入RF和SVM模型，其中RF的平均残差值为0.00122，SVM为0.00198（图3A）。RF的残差逆累积分布线主要位于SVM的残差线内（图3B），作者选择RF模型来预测ESCC的本征基因。ESCC组误差（红色）、正常组误差（绿色）和总样本误差（黑色）的交叉验证***小误差点为.076，对应于18个***随机森林树（图3C）。通过平均Gini评分下降，HNRNPC、FMR1以及YTHDF1是与ESCC显著相关的m6A调节因子（图3D）。

图2 使用机器学习在作者的RNA-seq数据中找到ESCC相关的m6A调节因子

图3 使用机器学习在TCGA-ESCA数据库中查找与ESCC相关的m6A调节器

3. 食管鳞状细胞癌相关m6A调节因子预测能力的验证

通过Venn图，在作者的RNA-seq数据和基于机器学习的TCGA-ESCA数据库中筛选出的与ESCC显著相关的m6A调节因子交集，然后筛选出本研究中***终与ESCC相关的m6A调节因子：YTHDF1和HNRNPC（图4A）。作者构建了列线图，以直观地展示ESCC相关m6A调节器对正常组和ESCC组的预测能力（图4B）。列线图显示，YTHFD1对ESCC风险的贡献***，其次是HNRNPC。这些系数用于分配这些独立因素的分数。***，这些分数的总和可以用来预测ESCC的风险（图4B）。根据ROC曲线，作者得出模型的AUC为.877（图4C）。列线图的校准图如图4D所示，这表明ESCC概率的预测风险与真实世界的观察结果非常一致。同时，作者还建立了临床决策曲线预测模型。结果显示，当YTHDF1和HNRNPC被用作预测ESCC发生的标志基因时，患者的净增益更高，这表明该模型值得使用（图4E）。***，在临床决策曲线的基础上，进一步绘制了临床影响曲线（CIC）。红色曲线（数字高风险）表示在每个阈值概率下被模型分类为阳性（高风险）的人数。蓝色曲线（有结果的高风险数字）是每个阈值概率下的真阳性数量。结果表明，蓝色曲线在红色曲线内，表明该模型具有良好的分类能力。这也表明YTHDF1和HNRNPC可以被认为是与ESCC发病机制显著相关的生物标志物。同时，作者还根据YTHDF1和HNRNPC的RNA-seq数据进行了PPI分析。

图4 确定与ESCC相关的m6A监管机构，建立风险模型，并验证模型预测能力

4. 食管鳞状细胞癌危险性分组的预后和临床病理意义

关于AUC值为0.877，在TCGA-ESCA数据库中生成热图，显示高风险组和低风险组的临床病理特征、HNRNPC和YTHDF1 mRNA表达水平的差异。值得注意的是，高危组与晚期N期（p<.05）和M期（p<.05）显著相关（图5A）。同时，进行了单变量和多变量COX分析，其中TCGA-ESCA数据库中的单变量分析中，风险分组和TNM分期与OS显著相关。当将统计学显著特征纳入多变量分析时，***终，风险分组和TNM分期也被确定为ESCC患者的独立预后因素（图5B，C）。然后，作者在TCGA-ESCA队列中通过Kaplan-Meier生存率分析验证了风险分组的预后作用，该分析显示，高危组患者的总生存率明显低于低风险组患者（图5D）。

图5 TCGA-ESCA数据库中风险分组的临床意义

5. YTHDF1和HNRNPC在食道鳞状细胞癌组织和临床食管鳞状细胞癌队列中的实验验证

由于YTHDF1和HNRNPC在mRNA水平上的表达如图1所示，其中，作者的RNA-seq数据和TCGA-ESCA数据库的结果显示，YTHDF1与HNRNPC的表达显著高于正常组织样本。然后，在从华西医院采集的5对新鲜冷冻ESCC标本和相关的邻近正常组织中，通过蛋白质印迹验证YTHDF1和HNRNPC在ESCC组织中的蛋白质水平。与邻近的正常组织相比，ESCC组织中YTHDF1和HNRNPC的蛋白水平均显著较高（图6A）。为了更准确地检测YTHDF1和HNRNPC在ESCC中的表达，作者对ESCC组织切片进行了免疫组织化学检查（图6B）。表1和表2中列出了ESCC组织切片中YTHDF1和HNRNPC表达的临床病理特征。就生存率而言，中位随访时间为20.6个月，在作者的研究中为1.0至61.6个月。根据Kaplan-Meier曲线，具有较高HNRNPC（p=0.003，图6C）和YTHDF1表达（p=0.017，图6D）的ESCC患者的预后分别显著较差。经过Cox多变量回归分析，YTHDF1和HNRNPC的表达分别是与ESCC相关的独立预后因素。通过作者的RNA-seq数据分析了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），以找出与YTHDF1或HNRNPC潜在的相关基因（图6E）。相关分析表明，所有调节因子均呈正相关，其中METTL3、DDX5、DDX3X、ALKBH5和FTO均与HNRNPC显著相关。

图6 Western印迹、免疫组织化学染色和PPI网络分析对YTHDF1和HNRNPC的实验验证

总结

在这项研究中，作者使用作者医院的转录组数据和TCGA-ESCC数据库，通过机器学习筛选出两种与ESCC相关的m6A RNA甲基化调节因子：YTHDF1和HNRNPC。WB和IHC证实了YTHDF1和HNRNPC的表达与ESCC患者的预后和临床病理特征的相关性。基于作者构建的m6A RNA甲基化调节因子的风险预测模型，这可能为未来制定诊断和治疗策略提供重要信息。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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