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导语

今天给同学们分享一篇非肿瘤+机器学习+实验的生信文章“Identification of FCN1 as a novel macrophage infiltration-associated biomarker for diagnosis of pediatric inflammatory bowel diseases”，这篇文章于2023年3月17日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。

儿科炎症性肠病（PIBD）的发病率在全球范围内一直在稳步上升。PIBD的延迟诊断会增加并发症的风险，并导致生长迟缓。为了改善长期结果，迫切需要确定用于PIBD早期诊断的新标志物。

1. FCN1作为PIBD诊断候选生物标志物的鉴定

分析GSE117993数据集中75名PIBD和55名非IBD儿科患者的粘膜表达谱，以确定PIBD的疾病特异性标志物。通过使用LASSO和mSVM RFE算法，对PIBD和非IBD之间总共373个差异表达基因（DEG）进行标记选择（图1A，B）。LASSO算法通过应用***小平均误差的λ，从DEG中鉴定出16个基因作为PIBD的诊断标记；mSVM RFE算法将6个标记识别为具有低错误率的PIBD的顶部特征（图1C，D）。然后，作者从这两种算法中获得了两个交集基因，FCN1和LINC01558（图1E）。FCN1和LINC01558的诊断功效在一个独立的PIBD数据集（GSE126124）中得到了进一步验证，该数据集由78个结肠活检和98个外周全血样本的表达谱组成。如图1F、G所示，FCN1在结肠和血液验证集中均显示出良好的诊断效果，曲线下面积（AUC）值分别为0.937和0.743。相比之下，LINC01558在结肠和血液验证数据集（AUCs，0.576和0.363）中没有获得良好的诊断性能。综合来看，上述结果表明FCN1可能是诊断PIBD的良好粘膜和循环生物标志物。

图1 FCN1作为PIBD诊断候选生物标志物的鉴定

2. FCN1在PIBD中上调并与免疫反应相关

FCN1在PIBD中的表达水平和潜在作用在很大程度上仍然未知。使用GSE117993，作者发现PIBD患者直肠活检中FCN1的表达显著高于非IBD对照组（图2A）。一致地，在GSE126124中，作者进一步证实，与非IBD受试者相比，来自PIBD患者的结肠活检和外周全血样本中FCN1的表达均增加（图2B，C）。此外，对从上述数据集中确定的PIBD和非IBD之间的DEG进行GO分析和MeSH富集分析。GO分析的结果清楚地表明，FCN1在前100个富集GO通路中具有高频率（31%）。在前10个显著富集的途径中，FCN1参与体液免疫反应、补体激活和吞噬作用（图2D）。图2E中的MeSH通路富集分析表明，FCN1与感染和炎症密切相关。这些结果表明FCN1在PIBD中上调并与免疫反应相关。

图2 FCN1在PIBD中上调并与免疫反应相关

3. FCN1对PIBD的粘膜诊断性能优于钙卫蛋白

为了从PIBD和非IBD之间的DEG中鉴定FCN1相关基因，作者进行了蛋白质相互作用分析。在14个已鉴定的FCN1相关基因中（图2F），S100A8和S100A9是钙卫蛋白的成分。与FCN1类似，与非IBD粘膜相比，PIBD粘膜中S100A8、S100A9和其他FCN1相关基因的表达均上调（图2G）。由于粪便钙卫蛋白（S100A8/S100A9）是临床实践中用于PIBD诊断的有用筛选生物标志物，作者将FCN1的诊断效果与S100A8和S100A9的诊断效果进行了比较，以确定FCN1的潜在临床价值。在结肠验证集中，S100A8和S100A9在PIBD中显示出有效的诊断性能，产生的AUC分别为0.920和0.877。值得注意的是，与S100A8和S100A9相比，FCN1在PIBD诊断方面表现出优异的性能（图2H）。这些结果进一步支持了FCN1在PIBD诊断中的潜在临床价值。

4. FCN1表达与M0/M1巨噬细胞浸润呈正相关

免疫细胞在IBD的发病机制中起着至关重要的作用。为了确定PIBD粘膜免疫细胞组成的变化，作者将CIBERSORT应用于GSE117993数据集的粘膜表达谱。作者发现，与非IBD对照相比，PIBD直肠粘膜中的免疫细胞景观发生了改变，包括巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞（图3A–F）。其中，与非IBD相比，PIBD中M0和M1巨噬细胞的推断粘膜丰度显著增加，而M2巨噬细胞的丰度降低（图第3A）。PIBD中静息肥大细胞和静息树突细胞均减少，而其活化形式增加，尽管没有达到统计学意义（图第3B、C）。PIBD中浸润性中性粒细胞、活化的CD4记忆性T细胞和浆细胞的丰度显著高于对照组，而PIBD中CD8 T细胞、幼稚B细胞和记忆性B细胞的丰度较低（图3D–F）。在另一个PIBD队列中也观察到免疫细胞组成的类似变化。

图3 FCN1表达与M0/M1巨噬细胞浸润呈正相关

为了研究FCN1表达与免疫细胞浸润之间的关系，作者进行了Spearman相关性分析。发现FCN1表达与巨噬细胞亚群之间的相关性***强，包括M0、M1和M2状态（图3G）。如图6所示，3H，FCN1的表达与CIBERSORT推断的M0巨噬细胞丰度呈正相关（Spearman’s r = 0.75，P = 2.6 × 10-24）和M1巨噬细胞（Spearman’s r = 0.71，P = 3.3 × 10-21），但在GSE117993 PIBD队列中与M2巨噬细胞丰度呈负相关（Spearman’s r = −0.62，P = 2.5 × 10-15）。FCN1和推断的巨噬细胞亚群之间的这些相关性在另一个PIBD队列中得到了进一步证实。

5. FCN1在PIBD结肠粘膜巨噬细胞中富集，并与高度炎症有关

为了进一步研究FCN1表达与巨噬细胞极化状态之间的关系，作者分析了非IBD和PIBD结肠活检的单细胞转录组数据集（GSE121380）（图4A）。FCN1几乎在CD68+巨噬细胞中表达，与非IBD相比，PIBD结肠活检巨噬细胞中FCN1和IL1B的表达水平显著增加（图4B）。与FCN1低巨噬细胞相比，FCN1高巨噬细胞中前10个上调的基因集中有几个与高度炎症有关，如通过NF-κB的TNFα信号传导、炎症反应、干扰素γ反应、补体和IL-6信号传导（图4C–E）。经典的M1巨噬细胞通常以促炎反应和TNF、IL-1、IL6和干扰素诱导基因的高表达为特征，这表明PIBD粘膜中富集的FCN1+巨噬细胞与促炎M1巨噬细胞相似。

图4 FCN1在PIBD结肠粘膜巨噬细胞中富集，并与高度炎症有关

然后，作者应用CellChat来破译PIBD结肠粘膜中的细胞间信号网络。有趣的是，作者在FCN1低/FCN1高巨噬细胞和其他主要细胞类型之间发现了许多不同的促炎信号网络，如与巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、细胞间粘附分子（ICAM）、CC趋化因子配体（CCL）和B细胞活化因子（BAFF）相关的途径（图4F）。与FCN1低巨噬细胞相比，FCN1高巨噬细胞通过MIF信号通路从B细胞、成纤维细胞和T细胞接收更多信号（图4G）。值得注意的是，相对于FCN1低的巨噬细胞，FCN1高的巨噬细胞也表现出自分泌ICAM和CCL信号增加（图4H，I）。此外，FCN1高巨噬细胞是靶向B细胞的BAFF信号的主要配体来源（图第4J）。这些观察结果支持在PIBD结肠粘膜中富集的FCN1高巨噬细胞有助于粘膜炎症。

6. FCN1在PIBD临床队列中表现出优异的诊断性能

与PIBD单细胞转录组分析的结果一致，免疫染色结果显示，与非IBD对照组相比，PIBD患者结肠活检中FCN1的表达显著增加（图5A），并且FCN1在PIBD结肠活检中与CD68+巨噬细胞特异性共定位（图5B）。考虑到肠粘膜中的巨噬细胞不断被循环的单核细胞更新，作者假设从全血样本中分离多核细胞可能会提高FCN1的血液诊断性能，因为多核细胞中单核细胞的比例高于全血。在作者的队列中，PIBD患者PBMC中FCN1、S100A8和S100A9的mRNA表达水平显著高于非IBD对照组，但LINC01558的表达在两组之间没有差异（图5C-F）。正如预期的那样，S100A8和S100A9在PIBD中显示出有效的诊断性能，而LINC01558表现不佳，AUC分别为0.843、0.929和0.314。值得注意的是，在作者的验证队列中，FCN1仍然显示出区分PIBD患者和非IBD对照的***灵敏度和特异性，AUC为0.986（图5G）。总之，这些结果进一步表明FCN1是PIBD诊断的一种有前途的生物标志物（图5H）。

图5 FCN1在作者的患者队列中诊断疗效的验证

7. 在小鼠结肠炎模型中，FCNB在血液、结肠和脾脏中的表达上调

作者的上述结果表明，在PIBD患者的结肠直肠粘膜、血液和PBMC中，FCN1的表达均增加。因此，作者使用DSS诱导的小鼠结肠炎模型进一步确定了FCN1在PIBD中的参与（图6A）。与对照组相比，暴露于DSS的四周大小鼠表现出体重减轻、结肠长度显著缩短和脾脏肿大（图6B–D）。DSS处理小鼠的结肠炎通过上皮变性和免疫细胞浸润的组织病理学分析确定（图6E）。小鼠FCNB与人类FCN1相似。与人类PIBD的研究结果一致，在DSS诱导的结肠炎小鼠的外周全血中，Fcnb的mRNA表达明显增加（图6F），并且在DSS诱导结肠炎小鼠的结肠和脾脏组织中，Fcnb的蛋白水平也增加（图6G，H）。

图6 小鼠结肠炎模型中FCNB表达上调并与CD68共定位

8. 结肠炎小鼠结肠黏膜中FCNB表达增加与炎症巨噬细胞浸润有关

考虑到FCN1+巨噬细胞在人类PIBD粘膜中的浸润增加，并且FCN1高巨噬细胞具有高表达的IL-1β，作者随后研究了在结肠炎小鼠模型中FCNB（人类FCN1的小鼠同源物）和IL-1β之间是否存在关联。不出所料，与对照组相比，结肠炎小鼠的结肠和脾脏组织中IL-1β的表达显著上调，FCNB高表达的组织也显示出更高的IL-1β表达（图6G，H），表明FCNB和IL-1β之间存在关联。此外，与对照组相比，在DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠组织中检测到FCNB+细胞浸润增加，这与人类PIBD中的发现一致（图6I）。更重要的是，FCNB与募集到结肠炎小鼠结肠中的CD68+巨噬细胞特异性共定位（图6J）。总之，这些结果表明，FCNB表达的增加与结肠炎小鼠结肠粘膜中的促炎巨噬细胞浸润有关。

9. FCN1促进巨噬细胞中胱天蛋白酶-1介导的IL-1β成熟

为了进一步研究巨噬细胞表型的变化是否与FCN1表达有关，产生了THP-1衍生的M0、M1和M2巨噬细胞（图7A）。与M0巨噬细胞相比，M1极化的巨噬细胞表现出FCN1和促炎细胞因子的表达上调，包括IL-6、促IL-1β和裂解的IL-1β，而M2极化的巨噬细胞则表现出FCNI和促炎因子的表达下调（图7B）。

图7 增加的FCN1+巨噬细胞浸润促进PIBD的肠道炎症

促炎细胞因子IL-1β主要来源于巨噬细胞，其生物激活通常需要NLRP3炎症小体依赖性胱天蛋白酶-1的切割。鉴于观察到的FCN1和IL-1β表达之间的相关性，作者质疑FCN1是否能调节IL-1β的激活。为了解决这一问题，作者在THP-1衍生的巨噬细胞中过表达了FCN1，并发现FCN1的过表达略微增加了NLRP3、裂解的胱天蛋白酶1和成熟的IL-1β的蛋白质水平（图7C、D）。考虑到PIBD患者肠道黏膜屏障缺陷和全身暴露于肠道源性内毒素（LPS）的增加，作者随后将THP-1源性巨噬细胞暴露于LPS。有趣的是，在LPS存在的情况下，FCN1的过表达增加了NLRP3的表达，并大大上调了裂解的胱天蛋白酶-1和成熟的IL-1β的蛋白水平（图7C、D）。一致地，在LPS存在的情况下，人重组FCN1蛋白（rhFCN1）也可以增加NLRP3、裂解的胱天蛋白酶1和IL-1β的蛋白水平。

总的来说，在PIBD的结肠粘膜中，FCN1+巨噬细胞的浸润增加，巨噬细胞FCN1通过NLRP3依赖性的胱天蛋白酶-1的裂解促进成熟IL-1β的产生，这有助于肠道炎症（图7E）。

总结

总之，作者的研究表明，FCN1是一种新的有前途的用于PIBD诊断的粘膜和循环生物标志物。表达FCN1的巨噬细胞在PIBD粘膜中富集，表现出促炎表型。此外，FCN1通过NLRP3依赖性切割巨噬细胞中的胱天蛋白酶1，极大地促进LPS诱导的促炎细胞因子IL-1β的激活。因此，靶向FCN1+巨噬细胞可能有助于缓解PIBD患者的肠道炎症。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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