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导语

今天给同学们分享一篇糖基化的生信文章“Analysis of Tumor Glycosylation Characteristics and Implications for Immune Checkpoint Inhibitor’s Efficacy for Breast Cancer”，这篇文章于2022年4月4日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为5.738。

糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，被认为是乳腺癌症发生和发展的关键事件。糖基转移酶的异常表达导致异常的糖基化模式，对BC结果具有诊断潜力。本研究旨在建立一种基于糖基转移酶的信号，以预测BC的预后和对免疫检查点抑制剂的反应。

1. 一致性聚类分析揭示了糖基转移酶基因的潜在细胞生物学效应

GO和KEGG通路分析被用来揭示糖基转移酶相关的不同表达基因（DEG）可能的细胞生物学效应。糖基转移酶基因的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）的前10个富集GO通路如图1A中的散点图所示。这些富集的GO通路与糖基化、高尔基堆积和转移糖基基团有关。KEGG分析还表明，糖基转移酶基因在O-聚糖、N-聚糖和糖脂生物合成中富集，如图1B所示。

图1 糖基转移酶基因的功能富集分析

2. 糖原特征的发展

通过Cox回归分析，发现13个不同表达的糖基转移酶基因与BC预后相关（p<0.05）（图1C）。LASSO回归被应用于进一步缩小基因的数量（图1D）。***，基于TCGA训练集中的1089例病例，筛选出9个选定的糖基转移酶基因（FUT7、ST3GAL1、ST3GAL3、ST6GALNAC4、B3GNT2、CHPF、POMNT2、ALG3和STT3A），以建立预后风险特征（图1E）。基于中位风险评分（0.976），作者将TCGA训练集中的1089例BC病例分为低风险组和高风险组。作者证实，与低风险组相比，高风险组的死亡患者比例明显更高。9个选定的糖基转移酶基因的表达特征如热图所示（图2A、B）。然后，作者使用验证集来进一步验证风险特征的普遍性。在训练集中具有相同风险特征的情况下，验证集被分为低风险组和高风险组。高危组也表现出更差的预后和不同的基因表达（图2B）。KM生存曲线显示，低风险组的OS、无病生存期和无进展间期明显更长（p<0.05）（图2C–F）。

图2 不列颠哥伦比亚省低危和高危人群糖基转移酶基因的表达及预后

3. 糖原特征的验证

基于TCGA数据集，单变量和多变量回归分析显示，风险评分与预后相关（图3A、B），这验证了糖信号是BC的一个稳健的独立预后指标。为了直接有效地预测1年、3年和5年的生存概率，作者构建了一个包括风险评分和临床病理因素的列线图（图3C）。校正曲线用于校正1年、3年和5年列线图的准确性，这表明列线图与实际生存率高度一致（图3D）。此外，作者绘制了与ROC曲线来评估风险特征。2年、3年和4年OS概率的AUC值分别为0.702、0.733和0.743（图3E）。此外，风险评分的AUC值比年龄、分期以及T、N和M分期的AUC值更高的预测能力（图3F）。

图3 糖信号的预后价值

4. 风险模型比较

选择了五个现有的预后风险模型（16-20）与作者的糖特征进行比较，并相应地绘制了五个模型的ROC和KM曲线（图4A，C）。然后，作者计算了与R中的“rms”包的一致性指数（C指数）。这一结果证明，该模型在3年时的AUC值高于五个模型，并且作者的模型具有***的C指数（图4B），表明作者的模型在六个预后风险模型中表现***。六个模型的HR和p值如图4D所示。

图4 风险模型比较

5. 风险特征的临床相关性

绘制热图以显示临床病理因素和9个糖基转移酶基因的分布（图5A）。相应的散点图进一步显示，年龄（图5B）、生存状态（图5C）、临床分期（图5D）、T分期（图5E）和N分期（图5B，作者发现，7对基因与风险评分呈正相关，2对基因呈负相关（图5H，I）。

图5 通过糖信号评估临床病理特征

6. 风险评分相关信号通路的基因集富集分析

为了探索两组中的富集途径，作者进行了GSEA。结果表明，cajal体、DNA包装复合体、果糖和甘露糖代谢、类固醇生物合成和紧密连接在高危人群中丰富，免疫反应的激活、适应性免疫反应、B细胞激活、哮喘、细胞因子-受体相互作用、造血细胞系、原发性免疫缺陷，并且T细胞受体信号通路在低风险组中具有更高的富集度（图6A、B）。许多与免疫反应相关的信号通路在低风险组中富集，表明高风险组处于免疫抑制状态。然后，作者基于签名中的总基因（图6C）、糖基转移酶基因（图6D）和9个选定的糖基转移酶类基因（图6E）进行主成分分析。结果表明，9个选定的糖基转移酶基因的表达谱在低风险组和高风险组中有很好的分化。

图6 风险评分相关信号通路的GSEA

7. 九个糖基转移酶基因的突变和拷贝数变化分析

作者对9个糖基转移酶基因进行了突变和CNA分析（图7A），表明基因变化的频率，包括基因扩增、深度缺失和错义突变，在0.4%至12%之间。ST3GAL1的扩增是9个糖基转移酶基因中***常见的CNA。此外，9个糖基转移酶基因在乳腺浸润性导管癌、乳腺浸润性混合粘液癌、乳腺侵袭性癌（NOS）和乳腺浸润性小叶癌中的突变频率和CNA如图7B所示，其中乳腺浸润性管癌的突变频率***。ST3GAL1的错义突变和截短突变定位于glyco_transfer_29区域（图7C）。瀑布图表明，两组中排名前20的基因具有显著不同的突变频率（图7D，E）。

图7 不列颠哥伦比亚省患者的基因改变

8. 糖基信号预测乳腺癌症免疫细胞浸润及对化疗和靶向治疗的反应

应用ssGSEA量化22个免疫细胞亚群和29个相关途径的富集分数，并比较两组中免疫细胞的比例和相关途径的活性（图8A、B）。低风险组具有高水平的免疫细胞浸润，如B细胞、CD8+T细胞和浆细胞。同时，所有29种免疫相关途径在低风险组中都有显著富集。此外，CD8 T细胞浸润在低风险组中较高，并且与BC患者的生存率呈正相关（图S2）。相关分析表明，风险评分与免疫细胞的比例呈负相关，与肿瘤突变负荷（TMB）呈正相关（图8C，D）。此外，作者分析了4个糖基转移酶基因的拷贝数变异（CNV）与BC免疫浸润水平之间的相关性，表明B3GNT2的臂水平缺失CNV和其他一些糖基转移基因的CNV与免疫浸润程度有关（图8E）。估计算法证实，在低风险组中，估计评分、基质评分和免疫评分显著较高，肿瘤纯度较低（p<0.05）（图9A）。此外，除排除外，低风险组的功能障碍、肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）以及微卫星不稳定性（MSI）明显更高（图9B）。此外，TIDE高、风险评分低的患者的结果***（图9C）。此外，高危组的BC患者的TMB高于低危组的患者，这支持了高危组BC患者中有更多的突变基因（图9D）。此外，RNA干性评分（RNAss）与风险评分相关，DNA干性评分（DNAss）也是如此（图9E）。这表明来自高危人群的肿瘤具有较高的肿瘤干度。基于GSE78220、GSE67501和IMvigor210队列（21），作者发现抗PD-1/PD-L1治疗的反应与风险评分呈负相关（图9F）。KM曲线显示，IMvigor210队列中低风险评分的患者接受抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治疗的预后更好（图9G）。此外，完全缓解（CR）/部分缓解（PR）组的风险评分低于稳定期疾病（SD）/进展期疾病（PD）组（图9H）。此外，免疫和肿瘤细胞PD-L1水平较低的患者风险评分较高，高风险评分与沙漠免疫表型密切相关（图9I-K）。这些结果表明，对抗PD-L1治疗有希望的反应可能会使低风险组的预后更好。

图8 高危和低危人群的风险模型与免疫状态的关系

图9 肿瘤微环境风险评分与免疫检查点抑制剂反应的相关性

作者使用SubMAP算法推测在BC患者的高风险和低风险组中进行抗PD1和抗CTLA4反应免疫疗法的可能性。结果表明，低风险组可能对PD-1治疗有更好的反应（Bonferroni校正p<0.01）（图10A）。然而，在低风险组和高风险组之间，CTLA4反应免疫疗法没有显著差异。肿瘤免疫周期可分为7个步骤，包括肿瘤抗原释放、抗原呈递、启动和激活、T细胞向肿瘤的运输、T细胞在肿瘤实体中的浸润、T细胞介导的肿瘤细胞识别和肿瘤细胞杀伤（22）。与高风险组相比，低风险组在七个步骤中的得分更高（图10B）。PD1、PDL-1和CTLA-4的表达水平与风险评分呈负相关（图10C）。此外，低风险组对抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治疗有反应的相对可行性更高（图10D–G）。为了评估作者的信号对化疗反应预测的疗效，计算了每种情况下阿霉素、雷帕霉素、依托泊苷和埃博霉素的估计IC50。研究发现，高危人群的药物敏感性较高（图10H）。

图10 风险评分预测BC对化疗和靶向治疗的反应性

9. 风险模型在外部临床队列和体外实验中的预测能力验证

为了验证糖基转移酶基因的表达与肿瘤浸润性免疫细胞（TIIC）之间的相关性，一个由20名不同临床阶段的BC患者组成的临床队列被纳入。通过qRT-PCR检测到的9个糖基转移酶基因的表达水平用于计算20名患者的风险评分（图11A）。之后，将临床队列分为低风险组和高风险组。结果与作者以前的模型非常一致。IHC证明STT3A在高危患者中过表达（图11B）。进一步的IF测定表明，低风险组的抗肿瘤M1巨噬细胞标志物增加，同时STT3A降低（图11C）。

图11 在临床队列中验证糖基转移酶与肿瘤微环境之间的相关性

STT3A沉默后（图12A，B），进行CCK-8分析以探索STT3A在BC细胞增殖中的作用，这表明STT3A的沉默抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖（图12C，D）。Transwell分析和伤口愈合表明，STT3A的沉默抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移（图12E–H）。总之，上述数据证明STT3A上调了BC细胞的增殖和迁移。为了分析BC样品中N-聚糖的表达，作者使用三种凝集素（ConA、PHA-L和PHA-E）进行凝集素印迹。ConA与α-连接的甘露糖（α-Man）结合。PHA-L可特异性结合β1,6-GlcNAc支链N-聚糖。PHA-E与具有二等分N-乙酰葡糖胺的二元半乳糖基化N-聚糖结合。ConA、PHA-L和PHA-E的强度显著增加，表明高危组中N-聚糖的表达更高（图12I）。此外，STT3A的沉默显著降低了MCF-7和MDA-MB-231细胞中N-聚糖的表达（图12J，K）。

图12 STT3A调节BC细胞的增殖和迁移

总结

作者成功构建了基于TCGA数据库中9个糖基转移酶基因。作者证实高危人群的预后和免疫抑制情况较差。此外，BC患者糖基转移酶水平的综合评估将有助于作者了解免疫浸润，并指导更有效的免疫治疗策略。作者的风险模型与金标准方法的结合将协同促进对抗BC的预后评估。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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