生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读5+非肿瘤+铁死亡+外部验证，看完就能拿捏SCI！！非肿瘤生信

导语

今天给同学们分享一篇非肿瘤铁死亡外部验证的生信文章“Analysis of ferroptosis-associated genes in Crohn’s disease based on bioinformatics”，这篇文章于2023年1月13日发表在Front Med (Lausanne)期刊上，影响因子为5.058。

铁死亡是一种新型的凋亡模式，***近已证明与纤维化，肿瘤，心血管和其他疾病有关。在这项研究中，使用生物信息学分析，我们确定了与克罗恩病（CD）相关的铁死亡基因并进行了生物学功能分析，确定了潜在的药物靶标，并为CD的未来治疗提供了新的方向。

1. 差异表达基因的鉴定

GSE186582包含来自196个CD样本和25个健康人类样本的数据，是从GEO数据库下载的。PCA分析清楚地区分了健康对照组和CD组（图1A），并使用limma包进行差异表达分析。作者发现CD患者结肠组织中有649个基因差异表达（p < 0.05和|log2 FC| > 1），与正常人结肠组织相比，其中316个基因上调，333个基因下调，如火山图所示（图1B）。使用作图包对差异表达的基因进行聚类（图1C）。

图1 差异基因分析

2. 铁死亡相关基因与维恩分析

接下来，在CD疾病中差异表达的基因中，作者想确定任何与铁死亡相关的基因的存在。为此，从FerrdB获得了487个与铁死亡有关的基因列表。然后，作者从GSE186582数据集和与铁死亡相关的基因进行差异表达的基因进行了取交集。作者发现总共有28个与铁死亡相关的基因（图2a），其中包括22种差异表达的基因，与铁死亡相关（IDO1，NOS2，GJA1，RARRES2，PROK2，ATF3，ATF3，MUC1，MUC1，ACSL1，ACSL1，DUOX2，EGR1，WWTR1，PTGS2，IL1B，LCN2 SLC7A11，TIMP1，CP，TRIB2，IL6，ACSL4，RBMS1，CREB1，CREB5）和6个下调的基因（DPP4，AQP3，ABHD12，DPEP1，DPEP1，AMN，LPCAT3）如热图中所示，将这些基因聚集（图2D）。将克罗恩病相关的基因分为三类：驱动基因（IDO1，GJA1，ATF3，DPP4，AQP3，ACSL1，DUOX2，EGR1，DPEP1，AMN，AMN，WWTR1，IL1B，IL1B，LPCAT3，LPCAT3，SLC7A11，SLC7A11，TIMP1，TIMP1，ACSS，IL6，ACSL4）、抑制基因（NOS2，Rarres2，Prok2，Muc1，ABHD12，LCN2，SLC7A11，CP，Trib2，IL6，RBMS1，CREB5）和标记基因（PTGS2）。

图2 分析与铁死亡相关基因

然后，作者研究了这些差异表达的基因的潜在生物学功能，这些基因与使用R和在线工具Metascape相关的基因。通过GO分析的***重要的富集项包括细胞的顶端部分，顶端质膜（细胞成分）；酰胺运输（生物过程）；血红素结合和四吡咯的结合（分子功能）（图3A – C）。此外，将28个基因上传到Metascape进行在线分析，如图所示，显着富集的生物学途径包括：白介素-4和白介素13信号传导，铁死亡，脊髓损伤和PID AP1途径。同样，生物学过程，例如调节脂肪细胞分化，细胞修饰的氨基酸代谢过程以及小分子代谢过程的调节（图3D，E）。

图3 功能富集分析

4. 蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析与逆转录相关基因

接下来，作者使用String Online工具的蛋白质 - 蛋白质相互作用数据库构建了一个网络图，以研究纤维毒化相关基因的作用，该基因包含28个节点和45个边缘。在字符串数据库中，节点表示基因，边缘表示基因相互作用，并且网络设置为默认值（相互作用得分> 0.4）。使用Cytoscape分析了这28个基因以构建网络图，其中3个基因未与其他基因形成任何网络，并且无关（图4A）。使用CytoHubba插件计算的前五个基因是IL6，IL1B，PTGS2，IDO1和NOS2（图4B）。

图4 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）和免疫浸润分析

5. 关键基因与免疫浸润的相关性

为了进一步了解关键基因与免疫细胞浸润的相关性，作者进行了ssGSEA分析。结果表明，IDO1、IL1B、IL6和PTGS2的表达与aDC、B细胞、DC、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、pDC、Tfh、Th1细胞、Th2细胞、TIL和Treg的浸润量呈正相关。NOS2与肥大细胞和T辅助细胞呈负相关（图4C）。这些结果进一步证明，这些免疫细胞在克罗恩病的进展中起了关键作用。

6. 筛选潜在药物靶点

由于作者缩小了与铁死亡和CD相关的关键基因列表，因此作者随后寻找这些靶点的潜在药物。为此，作者使用cMap筛选潜在的药理学靶点，并根据药物的连接性评分对药物进行排名和鉴定。结果显示，用于治疗CD的前十名药物是：曲前列尼，CG-930，美西律，利坦色林，LY-2140023，RS-102221，GW-501516，鹅去氧胆酸，酪氨酸-AG-1295，神经达嗪。

7. 关键基因的外部验证

此外，使用来自GEO数据库的另一个CD数据集GSE102133验证了先前生物分析的结果。作者观察到，在GSE102133数据集中，与正常受试者相比，五个基因PTGS2，IL6，IL1B，NOS2和IDO1在CD患者的结肠组织中的表达水平显着更高（p < 0.0001），验证了作者的结果（图5A-E）。为了探究这五个基因作为CD潜在生物标志物的有效性，作者对CD患者和正常受试者的结肠组织进行了ROC曲线分析。ROC 曲线的水平和垂直坐标分别表示敏感性和特异性，AUC 越大表示诊断模型越准确。PTGS2、IL1B、NOS2和IDO1的AUC值分别为0.9、0.936、0.931、0.935和0.936，IL6的AUC值为0.806。上述结果表明，这五个基因在CD患者和正常参与者之间具有显着差异，可以作为良好的诊断生物标志物（图5F-J）。GSE95095数据集中枢纽基因的表达具有统计学意义，如补充图1所示。

图5 关键基因的外部验证

8. 使用免疫组织化学验证潜在的生物标志物

在鉴定出的5个关键基因中，IL1B、NOS2和IDO1主要位于细胞质中;而IL6和PTGS2主要存在于细胞膜中，棕色或金色代表阳性表达。作者对CD患者和正常参与者的组织进行了免疫组织化学分析，以验证这些关键基因的表达。作者的结果表明，与健康人结肠组织相比，CD患者结肠组织中蛋白质IL6，IL1B，NOS2，PTGS2和IDO1的MOD值更高（所有P值均小于0.05）（图6A，B），表明与验证作者生物信息学分析的健康参与者相比，CD中的蛋白质表达更高。