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导语

今天给同学们分享一篇肿瘤甲基化结合诊断模型和表达验证的生信文章“Bioinformatics and Experimental Analysis of the Prognostic and Predictive Value of the CHPF Gene on Breast Cancer”，这篇文章于2022年3月15日发表在Front Oncol期刊上，影响因子为5.738。

美国***近的研究表明，乳腺癌症占女性所有新癌症诊断的30%，并已成为全球女性癌症死亡的主要原因。软骨素聚合因子（CHPF）是一种参与硫酸软骨素（CS）延伸的酶，也是许多癌症预后不良的新关键分子。然而，其在癌症发展和进展中的作用尚不清楚。

1. CHPF在癌症中高表达并与预后不良相关

在对从UCSC Xena获得的33个肿瘤的数据进行预处理后，使用limma软件包进行差异表达分析，以比较33个肿瘤样本和相应的正常样本中的CHPF表达（在这种情况下，只选择正常样本数>=5的肿瘤），ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD和UCEC，乳腺癌中的基因表达显著上调（图1A）。由于TCGA-BRCA肿瘤样本和正常样本的数量不相等，因此选择了配对分析，显示乳腺肿瘤样本中CHPF基因表达水平显著增加（图1B）。随后进行了KM生存分析，结果表明高CHPF表达组的预后较差（图1C）。此外，作者选择GEO数据集GSE20685进行进一步验证，并获得了与TCGA相同的结果（图1D）。当作者将临床病理因素和CHPF基因表达整合到单变量Coxrgression分析变量中时，作者可以看到CHPF基因的表达与预后相关，并作为一个风险因素发挥作用（图1E）。在这里，作者分析了CHPF基因在14对肿瘤和正常组织中的表达，发现CHPF在乳腺癌症组织中显著增加（图1F）。此外，作者通过蛋白质印迹法检测了六种乳腺细胞系中的CHPF蛋白水平。CHPF广泛存在于乳腺癌细胞系MCF-7和SUM1315中（图1G），因此选择这两个细胞系进行后续研究。

图1 CHPF在癌症中高表达并与预后不良相关

2. CHPF DNA甲基化与CHPF转录表达呈负相关，两者均与免疫渗透有关

在TCGA BRCA中，作者首先分析了CHPF基因中不同基因座发生甲基化的程度（图2A）。随后的相关性分析显示，CHPF转录物表达与cg03176520位点甲基化呈负相关（图2B）。KM生存分析显示，较高的CHPF cg03176520位点甲基化与较好的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关（图2C、D）此外，与高甲基化结合高CHPF基因表达组相比，cg03176520位点高甲基化和CHPF低基因表达的乳腺癌症患者的总体生存率显著增加（图2E）。作者还分析了肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。作者可以看到，免疫细胞在乳腺癌症肿瘤微环境中的浸润程度与预后相关（P=0.011）（图2F）。基于高和低CHPF基因表达组的免疫细胞含量分析结果显示，两组之间共有10个免疫细胞存在差异（P<0.05）（图2G）。相关性测试进一步分析了免疫细胞与CHPF基因之间的相关性，结果显示共有12个免疫细胞与靶基因相关（P<0.05）。本次，将免疫细胞差异分析和相关性分析结果进行交叉，共获得10个差异表达的免疫细胞（图2H）。对这10种不同免疫细胞的KM存活率分析显示，其中B细胞记忆、B细胞幼稚、T细胞CD4记忆静息、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1与存活率具有统计学意义，其中较高的巨噬细胞M0，巨噬细胞M1，B细胞记忆与不良预后相关（图2I）。除此之外，GSCA数据库分析的结果显示，CHPF DNA甲基化与B、CD8+T/CD4+T细胞、细胞毒性和衰竭的浸润水平显著负相关（图2J）。

图2 CHPF DNA甲基化与CHPF转录表达与免疫渗透

3.CHPF基因表达和CHPF DNA甲基化与临床病理参数的相关性

作者分析了BRCA患者的临床病理参数与CHPF基因表达和甲基化之间的关系。结果显示，与<=35岁的患者相比，35岁以上的患者CHPF表达上调（图3A），M1期患者的CHPF表达水平显著高于M0组（图3B）。尽管肿瘤分期、T期和N期亚组没有显著差异，但与同一组中的其他分类相比，IV、T4和N3期的CHPF表达似乎增加（图3C–F）。使用在线数据库bc GenExMiner，作者研究了CHPF表达与ER、PR、HER2之间的关系，从结果中，作者可以得出结论，CHPF分别显著主要存在于ER-、PR-、ER/PR-和HER2+组中（图3G–J）。在临床实践中，这些群体往往预后不佳。同时，在smartapp上在线分析CHPF cg03176520基序甲基化与乳腺癌癌症分期的关系，尽管没有得到阳性结果的支持，但作者仍然可以看到，在晚期IV样本中，CHPF cg03176520基序的甲基化程度较低。与其他阶段相比，样本的甲基化水平较低（图3K）。

图3 CHPF基因表达和CHPF DNA甲基化与临床病理参数的相关性

4.CHPF转录表达/DNA甲基化与免疫标记物的相关性

作者利用TISDB在线数据库评估了CHPF转录物表达/DNA甲基化与免疫标记物之间的关系（图4A–J）。CHPF转录物表达与免疫调节剂如BTLA、CD160、CD274、CD96、IL10RB、KDR、LGALS9、PVRL2、VSIR、CD40、CD40LG、CD70、IL6R、KLRK1、MICB、NT5E、PVR、TMEM173、TNFRSF14、TNFRSF 18、TNFRF 25、TNFSF9、TNFSF13、TNFSF1 5、ULBP1（1 < |对| < 3）与CD276、TNFRSF4、TGFB1呈强相关（|R|>3）。虽然CHPF DNA甲基化仅为阳性，与免疫调节剂无关，但没有负相关性。CHPF转录物表达与主要组织相容性复合体（MHC）相关分子HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DRB1、HLA-E、HLA-F、HLA-G、TAPBP呈弱正相关。除TAPBP外，CHPF DNA甲基化与所有MCH相关分子均呈显著负相关，特别是与HLA-B、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-E、HLA-F、TAP2强相关。就趋化因子和受体而言，CHPF转录物表达与CCL7、CCL11、CX3CL1、CXCL16呈弱正交，与CCR10呈强正交，与CXCL9、XCL1、CCR2CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8呈弱负相关。CHPF DNA甲基化与大多数趋化因子和受体显著正相关。有趣的是，作者发现与CHPF转录表达和CHPF DNA甲基化显著相关的免疫相关分子总是表现出相反的趋势。

图4 CHPF转录表达/DNA甲基化与免疫标记物的相关性

5.体外CHPF促进乳腺癌症细胞增殖、迁移和侵袭

由于在细胞系验证中，CHPF在MCF-7细胞和SUM1315细胞中的表达高于在正常乳腺细胞MCF-10A中的表达，因此选择这两种细胞系进行干扰，并分别用靶向CHPF的siRNA（S1和S2）或siCtrl（NC）瞬时转染MCF-7和SUM13115细胞。western印迹和RT-qPCR结果均显示，与对照细胞相比，CHPF siRNA转染的细胞中的CHPF显著减少（图5A、B）。克隆形成测定的结果表明，与对照组相比，敲低CHPF组的集落形成数量显著减少（图5C）。在CCK8增值测定中下调CHPF表达后，MCF-7和SUM1315细胞的增殖显著降低（图5D）。此外，EDU掺入分析还显示，与相应的对照细胞相比，CHPF干扰组中EDU阳性MCF-7和SUM1315细胞的比例显著降低（图5E）。伤口愈合和侵袭试验的结果表明，对CHPF的干扰降低了MCF-7和SUM1315细胞的迁移能力和侵袭能力（图5F、G）。此外，在CHPF敲低的MCF-7和SUM1315细胞中，EMT相关基因N-钙粘蛋白、Snail和Vimentin的蛋白水平下调，而E-钙粘蛋白的蛋白水平上调（图5H）。

图5 体外CHPF促进乳腺癌症细胞增殖、迁移和侵袭

6.CHPF可改变ECM受体相互作用和PI3K-AKT通路相关基因的表达

为了进一步了解CHPF诱导BRCA转移的分子机制，作者使用TCGA-BRCA数据进行了生物信息学分析。将样品分为高和低CHPF基因表达的两组，并分析两组中所有基因的差异表达，以|logFC|>1和调整后的P值<0.05为筛选条件，共筛选出三个差异表达基因，即MMP11、COMP和COL6A2。GO富集分析显示，差异基因主要与细胞外基质相关术语有关，这些术语通常与肿瘤侵袭性有关（图6A），而KEGG途径富集分析显示差异基因主要富集于ECM受体相互作用和PI3K-AKT途径（图6B）。ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路相互交联，由许多参与细胞运动和癌症转移的基因组成，这与CHPF基因的促转移作用一致。对KEGG中***显著富集的ECM受体相互作用途径进行了GSEA富集分析，结果显示该途径与CHPF基因表达呈正相关。作者使用GEPIA来验证上述三个基因与CHPF基因之间的相关性，结果显示所有上述基因都与CHPF基因组显著相关（图6C-F）。

此外，还进行了蛋白质印迹以验证PI3K-AKT信号通路的关键基因。根据结果，可以看出，CHPF敲低组的P-PI3K和P-AKT水平低于对照组（图6G）。随后，作者选择了在两组中差异表达并参与ECM受体相互作用和PI3K-AKT途径的基因进行定量实时PCR验证（倍数变化>1.5）（图6H）。这次作者分析了总共13个基因的mRNA水平变化，其中10个基因随着CHPF基因的改变而改变。其中，只有COL6A2和SDC1在CHPF敲低时显著增加。相反，在GEPIA数据库中，COL6A2确实与CHPF呈正相关，这与作者目前的发现相反。