生信分析，生信分析公司，医学sci，生信分析学习，tcga数据库，geo数据库，单细胞测序，转录组分析，甲基化，医学sci写作，论文解读8+非肿瘤+预测模型+分型+免疫+实验验证生信思路，高分文章这么做！非肿瘤生信

导语

今天给同学们分享一篇非肿瘤结合分型并对预后、免疫和功能途径进行分析的生信文章“Bioinformatics-Led Discovery of Osteoarthritis Biomarkers and Inflammatory Infiltrates”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。骨关节炎是***常见的慢性疾病，其分子机制仍未得到解释。研究旨在利用生物信息学方法鉴定骨关节炎的关键生物标志物和免疫浸润。

图1 研究流程图

1. 关节炎患者免疫相关基因的表达

从GEO数据集中删除批次效应以获得数据集（图2），其中包括69个关节炎样本和34个对照样本。关节炎样本和对照样本的差异研究显示105DEGs；其中83个被上调，22个被下调（图3A、B）。图3C显示了来自三个数据集的免疫相关基因的交集和免疫相关基因上DEG的交集。这些交叉点产生了28个Imm-DEG（图3D），其中26个具有上调的表达亚型（图3E），2个具有下调的表达亚型（图3F）。为了分析Imm-DEG的整体表达，绘制了关节炎样本和对照样本中Imm-DEG表达水平的热图（图4A）和直方图。大多数基因在关节炎样本中的表达水平高于正常样本（图4C），并且Imm-DEG的位置在人类染色体上进行了注释（图4B）。

图2 GEO数据处理

图3 免疫相关基因和差异表达的免疫基因（Imm-DEGs）

图4 Imm-DEGs在关节炎中的表达水平

2. 构建风险模型

LASSO算法用于从28个Imm-DEG中识别出16个对关节炎有很大影响的特征基因（图5A、B）。基于16个特征基因的系数（图5C），将基因表达乘以相应的系数并相加得出关节炎评分（图5D）。同样，研究了16个基因特征的ROC曲线以预测关节炎，结果揭示了所有16个基因特征的预测功效（图5E）。

图5 关节炎模型的构建

根据患者的预测风险评分和16个特征基因创建线图模型，以预测患者关节炎的患病率（图6A、B）。校准曲线显示线图模型预测与理想模型的预测几乎相同（图6C），决策曲线分析或复合遗传模型中的单一预测风险评分优于随机模型。这些结果表明，基于线图模型的决策可能对关节炎患者有益（图6D）。

图6 列线图

检查了基因表达水平之间的相关性和16个基因特征之间的功能相关性。IGKV1-17、IGLC1和其他基因之间的功能相关系数达到0.9（图7B）。在所有样本中，IGKV1-17与IGLC1的相关系数为0.95；ADIPOQ与LEP呈正相关，但与除ADIPOQ外的所有其他基因呈负相关，LEP与除ADIPOQ外的所有其他基因呈负相关（图7A）。在关节炎样品中，IGKV1-17和IGLC1之间的相关系数为0.94；ADIPOQ与LEP和SPP1呈正相关，与除ADIPOQ外的所有其他基因呈负相关。同样，LEP与除ADIPOQ外的所有其他基因呈负相关（图7C）。OGN基因也与其他大多数特征基因呈负相关。在对照样品中，IGKV1-17和IGLC1之间的相关系数为0.89（图7D）。

图7 基因表达水平之间的相关性

3. 聚类分析

利用R软件中的ConsensusClusterPlus包和基于16个特征基因的一致聚类方法建立了两种免疫亚型（clusterA和clusterB）。集群A中有34个样本，集群B中有35个样本。然后创建了所有差异表达的免疫基因的热图，以显示两组之间免疫基因表达的显着差异（图8A）。ADIPOQ、LEP、OGN和TAC1在集群A中的表达水平显着低于集群B，而HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1HLA-DRA、TLR7、CCL18,CXCL10,MMP9,BLNK,IGHM,IGKV1-17,IGLC1,IGLV1-44,CXCL13,CXCL6,CXCL9,SPP1,IL10RA,SDC1,TNFRSF17,TRBC1的表达量在A集群中显着高于B集群（图8B).同样，评估了针对两个类别分别预测的16个基因特征的ROC曲线，结果表明所有16个基因特征都具有良好的分类效果（图8C）。

图8 关节炎患者基因特征的一致性聚类

4. PPI免疫基因网络

为了探索差异表达的免疫基因之间的关系，作者提取了DEGs、Imm-DEGs和基因特征的PPI网络。如Cytoscape中所示，DEG的PPI网络具有211个配对相互作用和75个基因；MMP9与19个DEG密切相关，而CXCL10与16个DEG相关（图9A）。同样，Imm-DEGs的PPI网络包含58个互惠对和24个基因；CXCL10和MMP9与10个差异表达的免疫基因密切相关，而CXCL13和HLA-DRA都与8个差异表达的免疫基因相关（图9C）。基因特征的PPI网络包含25个相互作用对和15个基因，其中CXCL10和MMP9与10个Imm-DEG密切相关，而CXCL13和HLA-DRA均与8个Imm-DEG相关（图9E）。为了验证基因在三个PPI网络中的功能，使用ClueGO进行了功能富集分析。结果显示，PPI网络中的基因在脂肪细胞因子信号通路、糖酵解/糖异生、Toll样受体信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体IL-17信号通路的相互作用以及类风湿性关节炎等通路中富集（图9B）。PPI网络中差异表达免疫基因的基因富集参与了IgA产生的肠道免疫网络、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（图9D）。

图9 免疫相关基因PPI网络

5. 两种不同免疫亚型的差异分析

为了分析两种免疫亚型之间的差异，在亚型之间获得了168个DEG：A组和B组，包括A组中上调的93个DEG和下调的75个DEG（图10A）。热图显示这些DEG可以区分两种不同的免疫亚型（图10B）。

图10 两种不同免疫亚型的差异分析

随后，作者分析了两种免疫亚型之间DEGs在患者生物学相关功能中的作用。首先，对DEG进行了功能注释（图11A），其次，在KEGG通路分析中，这些DEG在细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、疟疾和肿瘤坏死因子(TNF)信号以及NOD样受体信号通路中得到了丰富（图11B）。

图11 两种不同免疫亚型之间的功能分析

接下来，作者对两种免疫方式之间的所有基因进行了GSEA，这两种免疫方式在生物学过程中有显着差异，例如集群A中免疫反应的激活、基于免疫球蛋白超家族域构建的免疫受体体细胞重组的适应性免疫反应、α-βT细胞活化和抗原结合。相反，初级酒精代谢过程、胰岛素样生长因子受体信号通路的调节、脂质氧化和视黄醇代谢等生物过程受到抑制（图12A）。趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用、移植物抗宿主病、利什曼原虫感染和NK细胞介导的细胞毒性被激活，而丁酸代谢、细胞色素p450对异生素的代谢、脂肪酸代谢、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解以及药物代谢细胞色素p450通路受到抑制（图12B）。

图12 两种不同免疫亚型之间的基因集富集分析(GSEA)

6. 两种模型之间免疫亚型的差异

CIBERSORT算法用于评估两种不同免疫方式之间的免疫细胞浸润水平。CIBERSORT分析显示，集群A的静息树突细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、活化NK细胞和调节性T细胞水平明显低于B组患者（图13A）。然而，M1巨噬细胞、活化的肥大细胞、浆细胞、T滤泡辅助细胞和γδT细胞的水平显着高于集群B中的水平（图13B）。

图13 两种不同免疫亚型之间的免疫特性

还计算了A组和B组患者免疫细胞含量之间的相关性。A组中的患者显示出比幼稚B细胞更高比例的T滤泡辅助细胞。GammadeltaT细胞的比例高于M1巨噬细胞。此外，T滤泡辅助细胞和激活的记忆CD4T细胞显示出显着的正相关，而激活和静息的肥大细胞、M2巨噬细胞和幼稚B细胞显示出显着的负相关（图13C）。同样，在B组患者中，γδT细胞、M1巨噬细胞、T滤泡辅助细胞、γδT细胞和活化的肥大细胞与调节性T细胞呈正相关，而调节性T细胞与M1巨噬细胞呈负相关，调节性T细胞和γδT细胞（图13D）。还针对所有关节炎患者（图13E）、集群A（图13F）和集群B关节炎患者（图13G）计算了16种基因特征与免疫细胞类型之间的相关性。TAC1与群集B关节炎患者的免疫细胞含量不相关，静息记忆CD4T细胞和活化的NK细胞与基因特征不相关（图13G）。

7. qPCR数据验证

为了验证生物信息学结果，进行了qPCR实验。结果显示，TCA1、TLR7、MMP9、CXCL10、CXCL13、HLA-DRA和ADIPOQSPP1的mRNA表达水平在IL-1β诱导组中显着升高，其中CXCL10表达差异***显着。两组间LEP表达差异无统计学意义。这说明数据挖掘的结果是可靠的，具有潜在的研究价值（图14）。

图14 qPCR验证

总结

总之，进行了生物信息学研究以比较骨关节炎组和对照组的免疫浸润。TCA1、TLR7、MMP9、CXCL10、CXCL13、HLA-DRA和ADIPOQSPP1在IL-1β诱导组中的表达水平明显高于骨关节炎组，作者的数据还表明骨关节炎可能与免疫反应有关，这些研究提高了作者对骨关节炎发展的理解。这项研究的结果将有助于解释关节炎的免疫调节网络，并启发更有效的治疗方法。然而，重要基因与免疫浸润的功能和关联，以及免疫浸润模式在骨关节炎发展中的意义，还需要进一步研究。对非肿瘤感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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