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学到就是赚到!6+甲基化相关基因生信风险模型

基因组分析 管理员 251℃ 0评论
学到就是赚到!6+甲基化相关基因生信风险模型插图

今天给同学们分享一篇关于卵巢癌甲基化调控相关预后模型的文章“A ten-gene methylation signature as a novel biomarker for improving prediction of prognosis and indicating gene targets in endometrial cancer”,这篇文章是今年4月发表在Genomics杂志上的文章,影响因子IF=6.2。作者先是搭建了甲基化风险模型,再通过ROC曲线、KM生存曲线和WGCNA分析,最终确定了影响子宫内膜癌的潜在靶点。

A ten-gene methylation signature as a novel biomarker for improving prediction of prognosis and indicating gene targets in endometrial cancer

10个基因甲基化标志物作为子宫内膜癌预后预测和基因靶点的新生物标志物

结果解读

1.数据获得以及病人信息

作者从TCGA下载了子宫内膜癌(EC)的甲基化数据,包含29例正常样品和416例EC样品,并对这416例样品进行分类,如下表所示。

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416例EC患者的临床病理特征

2.DEGs 和 DMGs 的鉴定

作者使用“limma”包分别鉴定正常子宫内膜组织和EC组织之间的差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs),差异基因筛选条件为log2FC>1&P<0.05 ,鉴定出739个DMGs。其中,低甲基化基因275个,高甲基化基因464个(图A)。DEGs组鉴定出1293差异基因,其中上调基因753个,下调基因540个(图B);随后通过韦恩图取交集,得到132个基因(图C),132个基因在正常组和EC组中的甲基化表达如图D所示。

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子宫内膜癌患者DMGs和DEGs的差异表达

3.基于10个甲基化基因的风险评分模型构建

作者使用“glmnet”包进行LASSO回归分析,共132个交集基因。LASSO回归分析发现,ADCYAP1、CDX2、FAM179B、GABRA2、HIST1H2BE、LGALS9B、OXT1、RIPPLY2、STON1-GTF2A1L、ZNF876B这10个基因与EC的不良预后有关(图A)。与正常对照相比,这10个甲基化基因在肿瘤组织中显著异常表达。与正常组织相比,EC组织中LGALS9B和STON1-GTF2A1L表达下调,而ADCYAP1、CDX2、FAM179B、GABRA2、HIST1H2BE、OXT1、RIPPLY2、ZNF876B表达上调(图B)。此外,10个基因的RNA表达与DNA甲基化水平呈高度负相关(图C),10个甲基化基因的甲基化程度相互呈正相关(图D)。

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EC患者预后基因的鉴定

4.风险评分模型与EC临床特征的相关性较强

根据10个基因建立预后模型,并根据风险评分中位值将EC患者分为高风险组(n = 208)和低风险组(n = 208)。热图显示了10个关键基因在高、低风险组及其不同临床病理组中的表达水平(图A)。生存状况如图B所示,可以看出大部分死亡患者分布在高风险组。KM生存分析结果显示,高风险组OS明显低于低风险组(图C)。ROC曲线显示,风险评分模型在不同的随访时间具有良好的预测和预后准确性(图D)。随后,通过风险评分模型和TCGA相关临床病理特征对生存率进行单变量和多变量Cox回归分析,结果表明,10个基因甲基化风险模型可用作独立预后指标(图E)。

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高风险和低风险人群中EC的鉴别临床病理因素和预测准确性

5.列线图的验证

多因素分析得出的3个独立的风险因素来建立一个适用的列线图,模型指数为0.796(图A)。校准图证明列线图预测的3年、5年和7年生存率接近实际生存率(图B)。此外,作者根据列线图中的风险评分,将队列平均分为3个亚组(低评分组、中评分组和高评分组)。高分组的生存曲线比中低分组的OS差(图C)。作者为了确定风险特征是否是有效的预后指标,绘制了ROC图。与队列中的表现相似,3年、5年和7年生存期的AUC分别为0.784、0.792和0.821(图D)。

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生存预测列线图的构建

6.WGCN关键模块的鉴定和探索

为了更好地理解风险评分模型和分子组之间的关系,作者选择了前25%的DEGs,从正常和EC样本中共获得了5155个基因进行WGCNA分析。WGCNA网络的软阈值为4(图A)。无尺度网络的拟合度为0.9,更接近真实的生物网络状态(图B)。然后构建这些共表达模块,并分成9个有意义的模块(图C)。通过分析基因模块和风险评分模型之间的关联,我们发现粉色模块具有最高的相关性(图D)。粉色模块中有144个基因,然后我们用Metascape分析了这些基因,结果显示了功能丰富集的前20个集群(图E)。然后作者用了DEGs从TCGA低甲基化基因(logFC>1,p<0.05)和Metascape绘制的前20个基因取交集,最终筛选出6个hub基因。分别是MMP12、PHLDA2、S100P、KRT16、KRT23和KRT86(图F)。这6个基因在EC样品中表达上调(图G)。基质金属蛋白酶(MMP12)是基质金属蛋白酶(MMPs)的家族成员,在细胞外基质调节和胶原代谢过程中起着关键作用。然而,MMP12在EC中的作用仍不清楚。因此,作者探索了基质金属蛋白酶在EC细胞株中的作用。

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加权基因关联网络(WGCNA)和hub基因的选择

7.敲除MMP12抑制EC细胞增殖、侵袭和迁移

作者发现在AN3CA细胞中MMP12蛋白水平明显升高,并首先比较了6个EC细胞系中MMP12的表达水平,结果表明AN3CA细胞中MMP12蛋白水平明显升高(图A)。为探讨MMP12在EC中的作用,作者构建了siRNA质粒,敲除MMP12在AN3CA和ishikawa细胞系中的表达。然后进行WB检测检测敲除的效率。结果表明,与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA组AN3CA细胞中MMP12的表达显著下调(p < 0.01,图B)。CCK-8分析显示在MMP12敲除组中AN3CA的增殖率显著降低(图7C)。作者采用Transwell法研究了MMP12对体外培养的内皮细胞侵袭和转移行为的影响。结果表明,与其他两个对照组(图F-G)相比,MMP12敲除组中的AN3CA表现出迁移(图D-E)和侵袭能力的显著下降。

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MMP12在AN3CA细胞系中的体外功能验证。

小结

本研究确定了10个甲基化相关基因的风险模型,它可以准确预测EC患者的预后。此外,作者利用这10个基因的甲基化特征结合临床病理特征开发了一个列线图模型,以帮助患者个体化OS的预测。最后,这项研究揭示了MMP12可能是EC的潜在治疗靶点。目前还没有研究探索MMPEC中的作用,该模型有助于从临床角度为EC确定一种新的预后生物标志物。对甲基化研究感兴趣的同学,欢迎咨询。

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