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“平平常常” 就 8+ ?这样做Myc-ceRNA生信网络,你也可以!

基因组分析 管理员 173℃ 0评论
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今天给同学们分享一篇关于肝细胞癌Myc相关的ceRNA预后特分析的生信文章“Construction of a Myc-associated ceRNA network reveals a prognostic signature in hepatocellular carcinoma”,这篇文章于今年5月份发表在Mol Ther Nucleic Acids杂志上,影响因子IF=8.886。文章作者在此研究中从多基因关联的角度更好地了解了肝癌的发病机制,从而为靶向联合治疗提供了新的见解。

Construction of a Myc-associated ceRNA network reveals a prognostic signature in hepatocellular carcinoma

构建Myc相关的ceRNA网络揭示了肝细胞癌的预后特征

1.转录组数据的研究过程

研究流程图如图1所示。作者根据Myc的标准中位值将371例HCC组织的转录组数据分为Mychigh肿瘤组和Myclow肿瘤组。作者从Mychigh肿瘤组和Myclow肿瘤组中选择差异表达的lncRNAs、miRNAs和mRNAs。并利用miRDB数据库和TargetScan进行miRNA-mRNA靶向预测,以构建ceRNA网络。

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图1.肝癌中Myc-ceRNA网络的流程图

2.肝癌中Myc过度表达的临床分析

为了探讨Myc是否影响肝癌中的基因表达,作者根据Myc的中位值将肝癌患者分为Mychigh肿瘤组和Myclow肿瘤组。在人类蛋白质图谱(HPA)数据库中,Myc的mRNA和蛋白水平在不同正常器官中均有表达(图2A)。肝癌基因组改变的Myc区域通过扩增表达,使366例HCC患者中有66例(18%)发生改变(图2B和2C)。Myc在肝癌组织中的表达(n=369)高于正常肝组织(n=160,p<0.01;图2D)。Myc的表达随着肿瘤侵袭的恶化而增加(图2E)。Kaplan-Meier生存分析显示Myc表达的预后潜力。

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图2.Myc的功能分析

3.肝癌中的差异RNA

为了更好地了解DE-RNAs与肿瘤发生相关HCC之间的关系,作者从TCGA数据库下载了基因表达数据来分析DE-RNAs。基因表达数据包含371个样本(lncRNAs,mRNAs);根据Myc的中位值将367个样本(miRNA)定义为Mychigh和Myclow。作者分析了Mychigh和Myclow肿瘤组之间的DE基因,标准为p<0.05和倍数变化(FC)≥ 1.5. 作者总共在各组中发现了589个lncRNAs、93个miRNAs和1125个mRNA。其中上调的DE RNA包括222(38%)个lncRNAs、65(70%)个miRNAs和696(62%)个mRNAs。下调的DE RNA包括367(62%)个lncRNAs、38(30%)个miRNAs和429(38%)个mRNAs。在图3中,火山图显示了RNA的分布(图3A),热图描述了15种重要的DE RNA(图3B)。

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差异基因的鉴定

4.DE-mRNAs的功能富集分析

为了更好地理解HCC的相关机制,作者利用Metascape数据库(图4A和4B),从GO和KEGG分析中探索了1125个DE mRNA的功能。细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MF)中最丰富的GO通路分别是“膜侧”、“对有毒物质的反应”和“有机阴离子跨膜转运体活性”。根据KEGG的富集分析,作者发现氧化还原过程、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号和过氧化物酶体途径参与HCC的途径。

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图4.DE-mRNAs的富集分析

5.ceRNA网络的构建及关键RNA的鉴定

作者使用miRNA靶标信息学工具来鉴定ceRNA中的DE RNA。ceRNA网络是使用Cytoscape 3.7构建的(图5A),包括19个lncRNAs、5个miRNAs和72个mRNAs。ceRNA网络包括19个lncRNAs(11个下调和8个上调)和5个miRNAs(4个下调和1个上调)。此外,72个mRNA(58个上调,14个下调)和5个miRNA(4个下调,1个上调)被用于构建ceRNA网络。作者采用了基于节点加权算法的ceRNA网络来识别高度交互的集群(图5B)。关键RNA包含14个lncRNAs(6个上调和8个下调)、5个miRNAs(2个上调和3个下调)和11个mRNAs(9个上调和2个下调)。

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图5.HCC的ceRNA网络

6.ceRNA网络中DE lncRNAs的综合分析

lncRNAs对miRNAs和mRNA的反应有影响,指挥着ceRNA网络的上游部分。lncRNAs的表达与癌症患者的OS相关,因此,作者在本研究中分析了19个ceRNA的DE lncRNAs,发现Mychigh肿瘤组(n=185)和Myclow肿瘤组的差异表达(n=186)(图6A)。在19个DE lncRNA中,作者通过单变量和多变量Cox回归分析筛选了潜在的预后相关lncRNA。最终通过风险评分方法确定lncRNA信号是HCC的重要预后因素。值得注意的是,使用风险评分对这两组进行分类,提高了基于Kaplan-Meier(p=0.0055)和ROC曲线分析意义。结果发现LINC02691和LINC02499是HCC的保护因子(图6B)。ceRNA网络的lncRNA在细胞质中起作用并参与下游基因的调节。因此,作者使用lncOCATOR在线工具来预测LINC02691,LINC02499,LINC01354和NAV2-AS4的位置。作者发现LINC02691的亚细胞位置在LNCipedia中没有序列记录。从LNCipedia获得的LINC02499,LINC01354和NAV2-AS4的转录物分析表明它们使用lncLocator在线预测在细胞质中的位置(图6C)。为了鉴定关于HCC患者存活的潜在重要RNA,作者对ceRNA网络中的每种RNA进行了DE分析,临床分期分析和Kaplan-Meier存活曲线。结果比较:4个LNCRNs(LIC02691、LIC0249、LIC01354和NAV2-AS4)在MyCHI肿瘤组(n=185)中相对于Myclow肿瘤组(n=186)被抑制表达;图6D);4个lncRNA与OS呈显著正相关(p<0.05)(图6E);

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图6.ceRNA网络中DE lncRNAs的综合分析

7.miR-212-3p作为靶标的功能分析

作者在HCC中搜索了潜在的重要miRNA。ceRNA网络中的5个DE miRNA(4个下调和1个上调)与OS相关。作者构建了四种miRNA的Kaplan-Meier存活曲线(图7A)。此外,与miR-212-3p表达低的患者相比,miR-212-3p表达高的患者预后较差。结果显示miR-212-3p是促进肿瘤生长的因子,miR212-3p在Mychigh肿瘤组高表达(图7B)。在371例肝癌中,miR-212-3p的表达随着高肿瘤淋巴结转移(TNM)阶段的增加而增加(图7C)。作者用癌症和癌旁数据进一步验证。作者发现miR-212-3p的表达水平在371例HCC组织中显着上调。在50对配对的HCC组织中,相对于非肿瘤组织,miR-212-3p在肝癌中高度表达(图7D和7E)。此外,通过信息学网站,作者发现miR-212-3p包括lncRNA基因的3’UTR区域有特异性连接。图7F显示了四种lncRNA的miR-212-3p的3’UTR结合位置。作者结合miRNA和lncRNA来验证ceRNA假说。高风险组具有高miRNA表达和低lncRNA表达,而低风险组具有低miRNA表达和高lncRNA表达。

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图7.DE miRNA的表达及生存分析

8.ceRNA网络中DE mRNA的综合分析

为了进一步了解生物学功能,作者探索了参与ceRNA网络的72种DE mRNA的预后价值。在ceRNA网络中,作者发现SEC14L2和SLC6A1是miR-212-3p的下游靶基因。根据Kaplan-Meier生存分析,SEC14L2和SLC6A1与预后延长显着相关(p<0.05),而ceRNA网络中剩余的mRNA在HCC中没有生存意义。SEC14L2和SLC6A1在Myclow肿瘤组中表达,并与低级别TNM分期相关(图8A和8B)。进一步验证显示,371例肝癌中SEC14L2和SLC6A的表达低于50例癌旁样本;50例样品以解释基因在癌症和癌旁组织中的表达(图8C和8D)。在HCC的SEC14L2和SLC6A1中未发现遗传改变;然而,在cBioPortal数据库中,366例患者中有1例(0.3%)患者的SEC14L2发生改变,366例肝癌患者中有5例(1.4%)患者的SLC6A1改变。此外,与取自Gene expression Omnibus(GEO)谱(图8E和8F)的配对正常组织样品(n=10)相比,SEC14L2和SLC6A1在肝癌中具有较低的表达(n=10)。

为了探索SEC14L2和SLC6A1在HCC免疫浸润中的作用,作者通过TIMER平台评估了差异表达基因与免疫细胞浸润之间的关系。SEC14L2表达与免疫细胞浸润呈正相关。SEC14L2和SLC6A1的表达与B细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的相关性最高(图 8G)。作者研究了SEC14L2和SLC6A1表达与免疫细胞基因生物标志物之间的相关性。结果与T细胞和T细胞衰竭的相关性最强。

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图8.SEC14L2和SLC6A1的分析

9.HCC中甲基化与SEC14L2表达的相关性

UALCAN数据库显示SEC14L2在HCC组织数据库中高度甲基化(图9A)。作者使用MEXPRESS数据库分析了SEC14L2甲基化与临床信息之间的关系。作者发现SEC14L2在各种临床因素中存在显著的甲基化,包括初始治疗后的新肿瘤事件、组织学类型、性别、肿瘤分期和OS。SEC14L2的甲基化发生在多个位点,包括cg03673688、cg22352499和cg23665603(图9B)。作者使用MethSurv数据库描述了SEC14L2甲基化位点与患者临床因素之间的关系(图9C)。

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10.lncRNA-miRNA-mRNA网络的构建

为了验证肝癌中的ceRNA机制,作者在分析后构建了一个lncRNA-miRNA-mRNA网络,其中包括四个lncRNA、一个miRNA和两个mRNA(图10A)。作者分析了Myc和这些关键RNA之间的相关性。作者发现miR-212-3p是一个连接连接基因,参与ceRNA途径,而lncRNAs通过优先包含miRNA反应区间接调节mRNA表达。作者分析了LINC02691、LINC02499、LINC01354和NAV2-AS4,发现lncRNAs通过相同的miRNA miR-212-3p与SEC14L2和SLC6A1呈正相关(图10B)。Spearman相关分析显示miR-212-3p在HCC的lncRNAs和mRNAs中呈负调控(图10C)。

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图10.lncRNAs与mRNAs的线性回归分析

小结

作者通过各种生物信息学分析,从基因组范围内的转录组数据中引入了Myc-ceRNA网络,以提供Myc-ceRNA在肝癌发病机制中的全面分析。这一方法确定了一些与预后密切相关的关键RNA,并为肝癌提供了潜在的预后和诊断生物标志物。对该思路感兴趣的老师,欢迎扫码咨询

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