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非肿瘤单细胞生信分析发7+,让你的科研起飞!

单细胞测序 管理员 6573℃ 0评论
非肿瘤单细胞生信分析发7+,让你的科研起飞!插图

今天给同学们分享一篇关于腰椎间盘突出症的免疫浸润状况确定生物标志物的生信文章“Revealing the Immune Infiltration Landscape and Identifying Diagnostic Biomarkers for Lumbar Disc Herniation”,这篇文章于今年5月份发表在Front Immunol杂志上,影响因子IF=7.561。文章作者在本研究中通过基因表达矩阵来确定参与IVD变性的免疫细胞的特定类型。然后,对参与这一过程的Hub基因进行筛选。单细胞分析揭示了NP细胞簇中Hub基因的表达模式,前瞻性临床实验证实了Hub基因表达的预后价值。

Revealing the Immune Infiltration Landscape and Identifying Diagnostic Biomarkers for Lumbar Disc Herniation

揭示腰椎间盘突出症的免疫浸润状况并确定诊断性生物标志物

1. 研究设计综述

研究设计的流程图如图1所示。简言之,LDH中的DEG是从GEO数据库中样本的基因表达数据中筛选出来的。然后将CIBERSORT应用于DEGs以鉴定LDH相关免疫细胞。接下来,使用WGCNA和相关测试来识别免疫细胞相关的hub基因。然后在单细胞水平上检测这些Hub基因的表达水平,并识别出几个LDH相关的NP细胞。最后,通过qRT-PCR和ELISAs验证hub基因表达水平,和LDH患者临床特征之间的关系。

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图1.研究步骤的流程图

2.DEGS的筛选

将数据进行批量校正、标准化和差异分析(GSE124272、GSE147383和GSE153761),以筛选IVD样本中的DEGs。共筛选出410个DEGs,包括195个下调基因和215个上调基因。使用火山图(图2A)将结果可视化。

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图2.髓核(NP)组织中的差异表达基因(DEG)和免疫浸润

3.退化IVD的免疫微环境特征

为了进一步揭示退化IVD中的免疫微环境,采用CIBERSORT方法分析了渗入IVD组织的特定免疫细胞类型。在所研究的22种免疫细胞中,结果显示退化IVD中的Tregs和巨噬细胞水平显著升高(p<0.05)(图2B),如图2C所示,通过进一步分析CIBERSORT评分,另一方面,肥大细胞、中性粒细胞和M1巨噬细胞之间存在正相关性,浆细胞、调节性T细胞和M1巨噬细胞的浸润之间呈负相关。

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图3.关键模块和基因的鉴定

4.免疫细胞相关基因的鉴定

WGCNA用于从410个DEGs中识别差异表达的免疫细胞相关基因,如图3A-D所示。将这些DEGs划分为模块,并用不同的颜色合并(图3A、B)。分析五个合并模块,其中三个基因模块与免疫细胞显著相关(图3C)。其中,我们选择了绿色模块,这是与巨噬细胞M0相关的最重要模块,相关性系数为0.58和p<0.001(图3D)。根据筛选标准筛选出15个基因,其中12个通过相关分析被选中。然后对这些关键基因的表达模式进行相应分析(图3E,F)。运用Cytoscape构建了这12个基因与其靶基因之间的相互作用网络(图3G)。接下来,为了获得更多关于这些基因的信息,我们使用Matascape进行了GO和KEGG分析,如图3H所示,基因富集到如白细胞介素信号传导和细胞因子产生的调节等信号通路。

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图4.单细胞测序数据的预处理和细胞簇识别

5.scRNA-seq数据显示IVD中存在高度的细胞异质性

为了确定IVD区段的单细胞水平转录组情况,我们采用了健康、非退化大鼠IVD的scRNA测试集。我们首先对基因表达矩阵进行了质量控制(图4A)。然后,对scRNA基因表达数据进行标准化,并筛选20个主成分(p<0.05)进行后续分析(图4B)。通过鉴别性降维树实现了降维过程分析(图4E)。然后使用T分布随机邻居嵌入(t-SNE)方法对细胞聚类进行无监督分析(图4C,D)。结果显示出高度的细胞异质性,其中IVD细胞被分离成四个主要的不同簇,包括软骨细胞(NP细胞)、成纤维细胞(AF细胞)、脂肪细胞和上皮细胞,这是通过singleR和细胞标记物确定的。接下来,测试了这些细胞簇中hub基因的表达模式。大多数关键基因在NP细胞中高度表达,并发现关键基因ID1在AF细胞中高度表达(图4F)。

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图5.髓核(NP)细胞的聚类,揭示关键基因表达模式

6.体外受精组织中NP细胞簇的鉴定

为了揭示NP细胞的详细异质性,我们通过上调值对scRNA-seq数据重新分组。根据基因表达模式确定了四个细胞簇,包括集群1、2、4和5(图5A)。然后分析细胞分化的程度。所有细胞都投射到一根和两个分枝上。有趣的是,集群5中的细胞主要位于根部,而集群1、集群4中的细胞主要位于左侧,集群2中的细胞大多数位于右侧(图5C)。根据hub基因标记,集群1、2、4和5被定义为RBB7+Pdlim5-、RBB7+Pdlim5+、RBB7-ID1+和RBB7-Pdlim5+细胞组(图5B)。接下来,我们通过追踪这些NP细胞组的基因标记来确定其分子特征(图5D)。其中,TOMM20、TOMM22和CXCL2被认为是集群1中的特异性标记基因(图6A-C)。TOMM20已被证明可诱导脂肪和肌肉组织的组织炎症反应(11)。据报道,CXCL2通过诱导M2-like巨噬细胞极化促进肿瘤细胞迁移。因此,我们将簇1命名为“NP炎症反应细胞”。包括TOMM7和胎盘表达转录本1(PLET1)在内的基因在簇2中特异表达。PLET1编码是一种在滋养层干细胞中特异表达的细胞表面蛋白。有趣的是,集群2中的功能丰富,包括调控外源性凋亡途径和对金属离子的反应,这表明集群2细胞参与软骨样细胞的多向维持和分化(图6B-D)。因此,簇2被命名为“NP修复细胞”。BNIP3、SOD2和其他基因在簇4中高度表达。簇4标记基因的富集结果表明,这些细胞对氧水平产生应答。簇4细胞提供细胞外基质结构成分,赋予抗压性(图7A,C)。因此,我们将簇4命名为“细胞外基质NP细胞”。簇5细胞具有高表达基因,包括CLU、MEF2A、MCAM57和FAM162A,它们是间充质干细胞和NP祖细胞的已知标记物(图7B-D)。结果表明,簇4细胞主要分布在两个分枝的根部。我们推测,这组IVD细胞包含NP祖细胞,其他研究人员已经提出。因此,我们将这组细胞称为“干细胞样NP细胞”。

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图6.髓核(NP)细胞簇的基因标记和功能分析

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图7.髓核(NP)细胞簇的基因标记和功能分析

7.LDH患者的Hub基因表达验证和细胞因子水平

每个研究组的Pfirrmann等级由一组腰椎间盘MRI表示,如图8A,B所示。qRT-PCR结果显示,IV级椎间盘退变和高免疫组的NP组织中ID1,RAP2C和PTPRK的表达水平均显着升高(图8C-E)。ELISA结果还表明,这些基因的表达与TNF-α呈正相关(图8G–I),而与TGF-β无关(p<0.05,r=0.492)。我们认为Hub基因的表达可能在慢性疾病如IVD变性中起作用(图8F)。

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图8.临床实验证实了生物信息学的结果

小结

在这项研究中,我们利用单细胞测序技术将IVD细胞分为四类,包括NP,AF,脂肪细胞和上皮细胞。还阐明了每个簇的相应基因标记,表明治疗IVD相关疾病的新靶点。接下来,我们对NP细胞进行了详细的聚类分析。根据轨迹分析,将NP细胞分成具有不同分化特征的两个分支。鉴定了四个NP细胞簇,我们推测每个簇的不同作用受某些基因表达的影响。推断簇1中的细胞通过免疫细胞如巨噬细胞负责炎症过程。簇4中的细胞也值得研究,因为它们的干细胞样特征具有很大的治疗潜力。簇2和簇3中的标记基因主要与应激和纤维化变化有关。NP和AF细胞的不同群体之间的关系需要进一步研究。对非肿瘤单细胞分析感兴趣的老师,欢迎扫码咨询

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