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4+非肿瘤生信分析+铁死亡/焦亡/自噬/代谢/免疫的万能钥匙,抓紧上车!!

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今天给同学们分享一篇关于生物信息学分析识别脑出血发病机制中潜在的铁死亡关键基因的生信文章 “Bioinformatics Analysis Identifies Potential Ferroptosis Key Genes in the Pathogenesis of Intracerebral Hemorrhage” ,这篇文章于今年6月份发表在 Front Neurosci 杂志上。影响因子为 4.674 。文章作者发现MAPK 1相关mRNA-miRNA-INcRNA相互作用链可作为脑出血后铁死亡发生和发展的生物标志物。作者研究了可能在ICH中起主要作用的关键miRNAs和lncRNAs。作者还构建了一个大鼠脑出血模型和一个使用跑步机训练的干预模型来验证上述假设。的研究结果将有助于理解脑出血后的铁死亡,为脑出血的临床诊断和治疗提供新的思路。

1. 差异基因铁死亡

从GEO数据库下载微阵列表达谱数据集GSE24265,通过比较PH值和相应的灰质和对侧白质获得差异基因。还从铁死亡数据库(FERDB)中获得了包括265个基因的数据集,并将它们与GSE24265交叉以识别铁死亡差异基因。一共发现了40个上调基因和5个下调基因。差异基因的热图和维恩图如图1所示。通过FERDB在线工具,差异基因进一步分类为铁死亡驱动因子、铁死亡抑制因子和铁死亡标记物。

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图一.在血周组织和正常组织中有1327个差异表达基因

2. 铁死亡差异基因的通路富集分析

使用在线工具Metascape、WebGestalt和DAVID对差异基因进行通路富集分析。首先,将PH样本和正常样本中差异基因的相关信息上传到WebGestalt软件。富集基因数据集分析结果表明,显著富集的基因参与TNF信号通路、MAPK信号通路、流体剪切应力、动脉粥样硬化和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(图2)。DAVID被用来分析ICH样本中45个差异基因的生物通路和过程。KEGG功能分析显示,TNF信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路和NOD样受体信号通路在基因组中被显著激活(图3)。其次,将45个差异基因上传到Metascape,结果表明,生物过程在氧化应激反应、多细胞生物稳态RNA聚合酶II启动子应激反应和细胞应激反应方面显著丰富。生物过程在应激反应中被显著激活。在TNF信号通路、流体剪切应力、动脉粥样硬化和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染中,生物通路被显著激活(图4)。值得注意的是,TNF信号通路是主要的生物学通路,由Metascape、WebGesta lt和DAVID鉴定。

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图2.通路富集结果

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图3.根据富集分数选择并显示了前八条富集通路

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图4.通路富集分析

3.铁死亡差异基因的蛋白质-蛋白质互作网络分析

得到了包含40个节点和330条边的PPI网络。45个基因中有5个与其他分子无关,也没有形成分子网络。在字符串在线数据库中将网络设置为默认截止点。基因用节点表示,基因间的相互作用用边缘表示。上调基因用蓝色标记,而下调基因用红色标记。来自Cytoscape的应用程序MCODE用于基因网络的聚类分析,以绘制关键模块。建立了具有一个下调基因(MAPK8)和17个上调基因的两个关键模块(图5)。这18个基因是MCODE筛选的关键基因。从涉及最高MCODE得分的TNF途径的关键模块分析确定的基因中选择感兴趣的基因,包括MAPK1、MAPK8、TNFAIP3、ATF4和SLC2A1。此外,使用Metascape对集群1进行的功能分析表明,这18个基因主要参与多细胞组织稳态、TNF信号通路和无机物质(图6)。

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图5.PPI网络

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图6.功能富集分析

4. miRNA进一步的相互作用和挖掘

在集群1中筛选了13个基因,并使用miRWalk 2.0软件进行了基因miRNA分析。miRWalk和miRTarBase数据库选择了有交集的miRNA,以确保结果的准确性和可靠性。筛选结果时采用以下标准:P<0.05,种子序列长度>7,目标基因结合区为3′UTR(图7)。具有较高数量交联基因的(miRNA≥2)。共有300个miRNA表达基因上传至Funrich,富集分析结果表明,分子功能在转录因子活性、蛋白丝氨酸激酶活性和受体结合方面显著富集。生物途径包括TRAIL信号途径、glypican途径和蛋白多糖syndecan介导的信号事件(图8)。

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图7.集群1基因与其靶向miRNA之间的互作网络

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图8.富集通路分析

5. lncRNA预测

9个miRNA具有较高数量的交联基因。只有hsamiR-15b-5P、hsa-miR-93-5P和miR-20b-5P具有上游分子lncRNA,并且具有更高的可靠性,它们都以MAPK1为靶点。用StarBase 2.0预测hsa-miR-15b-5P、hsa-miR-93-5P和miR-20b-5P的相应lncRNA。选择最高可靠性作为标准。交联后,发现了9个针对三个关键miRNA的lncRNA,即SNHG16、XIST、AC084219.4、RP11-379K17.11、CTC-444N24.11、GS1-358P8.4、CTB-89H12.4、RP4-773N10.5和FGD5-AS1。

6.qRT-PCR检测潜在生物标志物表达

五个基因被证实。它们具有较高的可靠性,主要与TNF信号和应激反应有关。MCODE鉴定SLC2A1、TNFAIP3、ATF4、MAPK1和MAPK8为两个簇中MCODE得分较高的基因。然后,使用qRT PCR在ICH样本中验证筛选的生物标记物,包括MAPK1、MAPK8、TNFAIP3、ATF4和SLC2A1。结果表明,脑出血大鼠的MAPK1、ATF4、SLC2A1和TNFAIP3的表达水平明显高于假手术对照组,而MAPK8的表达水平低于假手术对照组。运动训练后,与脑出血组相比,MAPK1、MAPK8和ATF4的表达水平较低。相反,TNFAIP3和SLC2A1通过运动训练上调(图9)。

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图9.PCR结果

小结

目前的研究发现了几个与脑出血后铁下垂密切相关的基因,其中一些基因在脑出血中尚未被提及。这些新基因为脑出血后的铁下垂提供了新的概念。发现应激反应通路,尤其是TNF信号通路,在脑出血后的铁下垂中极其重要。发现脑出血大鼠的MAPK8表达下调,而ATF4、MAPK1、SLC2A1和TNFAIP3表达上调。运动干预后,抗炎分子TNFAIP3和能量调节因子SLC2A1上调,而MAPK8、MAPK1和ATF4下调,这表明跑步机训练可能影响铁下垂。这些基因的鉴定可以为脑出血后铁下垂提供新的治疗靶点,MAPK1分子的调节网络可以影响脑出血后TNF信号通路。对非肿瘤纯生信+热点机制简单验证思路感兴趣的老师,欢迎扫码咨询

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