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泛素化预后生信模型+免疫组化=6+文章,太简单了吧?

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泛素化预后生信模型+免疫组化=6+文章,太简单了吧?插图

今天给同学们分享一篇关于透明细胞肾癌泛素相关预后标志物的生信文章 “Development of an individualized ubiquitin prognostic signature for clear cell renal cell carcinoma” ,这篇文章于今年6月份发表在 Front Cell Dev Biol 杂志上。本研究中,作者系统地探讨了这些泛素相关基因(URGs)在ccRCC中的分子特征和预后潜力,并初步揭示了这些分子及其调控网络所涉及的复杂生物学功能和免疫过程。

1.ccRCC中差异表达URGs的分析

由于与泛素相关的分子特征及其在ccRCC中的预后潜力尚不清楚,作者全面探讨了URGs在ccRCC中的关键作用和临床意义。图1显示了研究路线图。作者首先从TCGA数据库获得RNA测序数据,该数据库包含72份正常肾组织样本和539份ccRCC样本。随后,根据 log2 FC >1.0和FDR<0.05,共鉴定出204个差异基因,其中141个上调,63个下调。这些差异基因的表达分布如图2A、B所示。

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图1.透明细胞肾细胞癌(ccRCC)基于泛素的个体化预后特征制定流程图

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图2.ccRCC中差异表达URGs的表达和分布

2.基于URGs的预后特征的构建与评估

对于这些差异表达的基因,作者首先通过单变量Cox比例风险回归分析确定了114个预后基因。然后,回归分析进一步筛选出7种基因,包括CDCA3、CHFR、CORO6、RNF175、TRIM72、VAV3和WDR72。然后,作者对这七个基因进行多变量Cox比例风险回归分析,最终确定了与预后最相关的七个基因,包括CDCA3、CHFR、CORO6、RNF175、TRIM72、VAV3和WDR72。最后,作者使用多变量Cox比例风险回归分析的β系数来建立预后特征,并将这些系数乘以每个基因的表达水平以获得风险评分。TCGA队列中的ccRCC患者根据中位风险评分进行分组。通过Kaplan-Meier方法进行的生存分析表明,高危组患者的生存时间比低危组患者短(P=1.11e-16,图3A),这表明该特征能够准确区分预后不良的ccRCC患者。然后,作者根据ROC曲线分析评估基于URGs的风险特征的预测能力和准确性,ROC曲线下的预测面积(AUC)在1年时为0.735,3年时为0.702,5年时为0.744(图3B)。每个患者的风险评分和生存状态分布如图3C所示,表明较高的风险评分与较高的ccRCC患者死亡率相关。图3D显示了根据临床特征和风险评分评估的表达热图。此外,作者使用E-MTAB-1980队列作为外部队列,进一步评估预后特征在其他ccRCC患者队列中是否具有类似的预测性能和准确性。同样,采用Kaplan-Meier方法进行的生存分析显示,高危组患者的预后较差(P=0.032,图3E)。预测的AUC在1年时为0.725,3年时为0.703,5年时为0.742(图3F)。图3G显示了每位患者的风险评分和生存状态分布,图3H显示了基于临床特征和风险评分的E-MTAB-1980队列中的表达热图。此外,为了进一步验证预后特征,作者将TCGA队列分为两个相似的数据集(训练集,n=270;测试集,n=269),分别进行特征验证。在训练集中,生存分析显示高危组患者预后较差(P=4.704e-08,图4A)。预测的AUC在1年时为0.706,3年时为0.688,5年时为0.728(图4B)。每个患者的风险评分和生存状态分布如图4C所示。测试集的分析显示了类似的结果(图4D-F)。因此,作者有理由相信基于URGs的预后特征具有良好的预测性能和稳定性。

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图3.训练集预后特征分析

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图4.测试集预后特征分析

3.不同临床特征分层下的风险评分的预后意义

为了探讨基于URGs的预后特征的临床价值,TCGA队列中的ccRCC患者根据不同的临床特征(包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、T、N和M)进行分类。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析,结果表明,在不同临床参数分类下,各高危组患者的预后均不如低危组(图5),提示风险评分可以准确地识别不同临床条件下预后不良的ccRCC患者。这些结果表明,无论临床参数如何,七种基于URG的预后特征都可用于预测ccRCC患者的预后。

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图5.KM生存曲线分析按不同临床特征分组

4.基于URGs的预后特征与不同临床特征的关系

为了探讨预后特征是否可以评估肿瘤进展程度,作者比较了不同临床特征的风险评分差异。结果表明,按年龄、性别和N分类后,各组之间的风险评分没有显著差异(图6A、B、F)。然而,肿瘤3-4级的风险评分显著高于肿瘤1-2级(P=5.9e-13,图6C),肿瘤III-IV期的风险评分显著高于肿瘤I-II期(P=6.6e-14,图6D),肿瘤T3-4期的风险评分显著高于肿瘤T1-2期(P=2.5e-12,图6E),肿瘤M分期1-X的风险评分显著高于肿瘤M分期0(P=3.8e-07,图6G)。这些结果表明,预后特征可用于评估ccRCC肿瘤的进展程度,风险评分越高,肿瘤的恶性程度越高。

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图6.基于URGs的预后特征与临床参数之间的关系

5.评估预后URG与不同临床特征之间的相关性

除上述分析外,作者还根据不同的临床特点初步探讨了这七种URG在ccRCC中的可能作用。根据不同的临床变量对这些URG的表达水平进行分层,然后比较两组之间表达水平的差异。结果表明,CDCA3、CHFR、CORO6、RNF175、TRIM72、VAV3和WDR72与T分类显著相关;CDCA3、CHFR、CORO6、RNF175、VAV3和WDR72与M分类之间的相关性具有统计学意义。然而,没有基因与性别或N期有显著差异。这些结果提示,这些预后的URG可能在ccRCC的肿瘤进展中起重要作用,值得进一步研究

6.预后URG的多维调控网络与功能富集分析

泛素-蛋白酶体系统在一般转录过程中起着重要的调节作用,并通过此作用影响TFs的功能和活性。在研究中,作者从Cistrome项目下载了318个TF,根据TCGA队列提取了314个ccRCC相关TF,最终获得了66个差异表达的TF,包括46个上调和20个下调的TF。这些TFs的表达式热图如图7A所示。通过对差异表达的TF和预后性URG的共表达分析,共鉴定出54个参与调节的TF。URG-TFs的调控网络如图7B所示,其中10个TFs对相应的URG负调控,44个TFs对其正调控。为了研究这些差异表达的URG的分子功能和生物学通路,使用“clusterProfiler”软件包对这些URG进行GO和KEGG富集分析。生物过程分析表明,这些URGs主要集中在蛋白质多泛素化、蛋白酶体蛋白质分解代谢过程、蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、翻译后蛋白质修饰、蛋白质去泛素化、I-κB激酶/NF-κB信号传导,和蛋白质泛素化的调节(图7C)。细胞成分分析表明,这些URG主要集中在泛素连接酶复合物、cullin环泛素连接酶复合物和SCF泛素连接酶复合物中(图7C)。分子功能分析表明,这些URG主要集中在泛素蛋白转移酶活性、泛素样蛋白转移酶活性、泛素蛋白连接酶活性、磷酸酪氨酸残基结合和产生超氧物的NADPH氧化酶活性(图7C)。根据KEGG分析,这些差异表达的URG主要集中在泛素介导的蛋白水解、FcγR介导的吞噬、NOD样受体信号通路和破骨细胞分化中(图7D)

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图7.预后URG和功能富集分析的多维调控网络

7.评估预后特征与免疫细胞浸润程度之间的关系

免疫细胞浸润程度影响肿瘤进展和治疗效果。在本研究中,作者基于CIBERSORT算法评估了不同亚组之间免疫细胞浸润的差异。结果显示TCGA队列中每个样本中22个免疫细胞的组成存在显著差异(图8A)。具体而言,在高危组和低危组之间,血浆细胞、T细胞CD8、T细胞CD4记忆静息、T细胞CD4记忆激活、T细胞滤泡辅助、T细胞调节(Tregs)、单核细胞、巨噬细胞M1、树突状细胞激活、肥大细胞静息和嗜酸性粒细胞的浸润程度显著不同(图8B),这表明高风险组和低风险组之间的免疫状态可能存在差异。相关矩阵结果显示,T细胞CD8与T细胞调节因子(Tregs)具有最强的正相关,也与T细胞滤泡辅助因子呈正相关(图8C)

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图8.预后特征和免疫细胞浸润之间的关系

8.ccRCC患者不同临床特征的预后意义评估及列线图的构建

首先通过单变量Cox比例风险回归分析评估ccRCC患者不同临床特征的预后价值。结果显示,ccRCC患者的年龄(P<0.001)、肿瘤分级(P<0.001)、肿瘤分期(P<0.001)、原发肿瘤部位(P<0.001)、淋巴结浸润(P=0.049)、远处转移(P<0.001)和风险评分(P<0.001)与OS显著相关(图9A)。然而,多变量Cox比例风险回归分析显示,年龄(P=0.006)、肿瘤分级(P=0.018)、肿瘤分期(P<0.001)、原发肿瘤部位(P=0.030)和风险评分(P<0.001)作为独立预后因素影响OS(图9B)。接下来,基于这七个预后URG,作者建立了一个nomogram图,可以定量预测ccRCC患者的预后(图9C)。不同时间点的校准曲线结果表明,列线图的预测值与实际值之间具有很强的一致性(图9D-F)。此外,作者还使用TCGA和E-MTAB-1980队列进一步评估了列线图的临床适用性和有效性。使用Kaplan-Meier方法进行的生存分析表明,列线图可以准确识别TCGA和E-MTAB-1980队列中生存率低的ccRCC患者(P<0.001和P=0.002,图9G,I)。根据列线图,在TCGA队列中,预测的AUC在1年时为0.856,3年时为0.806,5年时为0.781(图9H),在E-MTAB-1980数据集中,预测的AUC在1年时为0.893,3年时为0.868,5年时为0.855(图9J),表明列线图具有良好的预测能力和准确性。

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图9.评估ccRCC患者不同临床特征的预后意义并构建列线图

9.IHC免疫组化分析

IHC分析用于初步验证这些URG在正常肾组织和ccRCC组织之间的蛋白表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,ccRCC组织中CDCA3(P<0.001)、VAV3(P=0.034)和WDR72(P=0.033)的表达较低。然而,与正常肾组织相比,CHFR(P=0.018)在ccRCC组织中高表达(图10)。

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图10.通过免疫组织化学染色分析验证预后URGs在ccRCC和正常肾组织中的表达

小结

总之,作者基于高通量测序表达谱数据集系统地探讨了URG在ccRCC中的分子特征和预后价值,初步揭示了这些分子及其调控网络所涉及的复杂生物学功能和免疫过程。他的研究结果将有助于揭示ccRCC的发病机制,开发新的生物标志物,并为临床决策提供一定的指导意义。泛素化标志物建模感兴趣的老师,欢迎扫码咨询。

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