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​用生信分析筛选出mRNA和lncRNA后怎么往下做?

基因组分析 管理员 202℃ 0评论

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今天和大家分享的是OncoTargets and Therapy 杂志(IF=3.34)上的一篇文章,“Potential Prognostic and Diagnostic Values of CDC6,CDC45, ORC6 and SNHG7 in Colorectal Cancer”。文章中作者通过基因表达谱分析鉴定了519个DEGs和485个DELs作为诊断CRC的候选生物标志物,并通过KM生存曲线和COX回归分析寻找与结直肠癌(CRC)患者生存结果相关的差异表达基因,最后用PCR验证了临床配对样本,用ROC曲线分析了CDC6、CDC45、ORC6和SNHG7的诊断作用,表明这四个基因可以作为CRC的潜在干预靶点。

Potential Prognostic and Diagnostic Values of CDC6, CDC45, ORC6 and SNHG7 in Colorectal Cancer

CDC6、CDC45、ORC6和SNHG7在结直肠癌中的潜在预后和诊断价值

一、研究背景

结直肠癌(CRC)是全球发病率最高的癌症之一,也是癌症死亡率的主要原因。结直肠癌的危险因素可分为两个方面:不可改变危险因素和可改变的危险因素。不可改变的危险因素主要有年龄,性别,种族,家族病史,遗传综合征,可改变的风险因素有不健康的生活方式吸烟和饮酒。尽管近年来外科手术技术和辅助化学疗法的进步改善了临床结局,但晚期患者的预后仍然不佳。随着技术的进步,全基因组分析已用于筛选和鉴定几种癌症中的关键基因。因此,需要找到CRC诊断和预后的标志物用于疾病管理。

二、结果解读

1 鉴定肿瘤和非肿瘤样品之间差异表达的DEGs(mRNA)和DELs(lncRNA)

作者研究了CRC与GEO的4个数据集的肿瘤和非肿瘤样本之间的DEG。四个数据集中有519个共有DEG,包括306个上调基因和213个下调基因。在TCGA数据库进行DELs差异分析,总共发现485个DEL,包括241个上调和244个下调的DELs。

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图1 癌和癌旁样本之间DEGs和DELs的鉴定

2 DEGs的功能富集分析

作者用DAVID 数据库进行GO分析以确定519个DEGs的生物学功能。GO分析结果显示,DEGs主要参与细胞分裂,蛋白质结合和趋化因子活性等通路有关;KEGG富集分析表明,DEGs主要参与细胞周期,矿物质吸收,DNA复制,氮代谢,造血细胞谱系和真核生物中的核糖体生物发生等信号通路。

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图2 DEGS的GO和KEGG通路富集分析

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表1 肿瘤与非肿瘤样本之间DEG的GO分析

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表2 癌和癌旁样品之间DEG的KEGG分析

3 CDC6,CDC45,ORC6和lncRNA- SNHG7在大肠癌数据集中的表达

作者选择CDC6,CDC45,ORC6(均参与细胞周期通路)和lncRNA SNHG7基因在四个GEO数据集进行进一步研究,在TCGA高表达CDC6、CDC45和SNHG7具有更好的无复发生存率和总生存率。

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图3 TCGA中不同水平CDC6、CDC45和SNHG7表达的生存曲线

接着作者在四个GEO数据集和TCGA数据库进行验证,与非癌组织相比,CRC组织中CDC6,CDC45和ORC6高表达,且CDC6和CDC45可能与TNM分期,淋巴结转移和远处转移有关,而ORC6的表达与浸润深度有关。与TCGA数据集中的非肿瘤组织相比,lncRNA SNHG7在CRC组织中也出现高表达。

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图4 四个数据集中CDC6、CDC45和ORC6的表达水平

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图5 TCGA中CDTC6,CDC45,ORC6和lncRNA SNHG7的表达

作者进一步分析发现CDC6和CDC45可能与临床症状TMN有关;并且ORC6的表达与浸润深度有关(p=0.003)。但SNHG7与 TNM分期、浸润深度、淋巴结转移和远处转移之间暂无显著性意义。

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表3 GSE39582数据集中CDC6,CDC45,ORC6表达水平与CRC临床症状的关系

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表4 TCGA中CDC6,CDC45,ORC6表达水平与CRC临床症状的关系

4 CDC6、CDC45、ORC6和Inc RNA SNHG7表达作为结直肠癌预后指标

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图6 GSE39582中不同水平CDC6、CDC45和ORC6的表达的Kaplan-Meier生存曲线

通过Kaplan-Meier生存分析,作者根据基因表达量将患者分为高表达组和低表达组。在GSE39582的CRC样本中,肿瘤样本中CDC6,CDC45或ORC6低表达的患者的无复发生存期明显较差。此外,低CDC6或低CDC45表达的患者OS较差且复发较早。在TCGA中,ORC6表达与CRC样品的OS和RFS之间无显著关系,而高SNHG7表达的CRC患者的OS显著低于低SNHG7表达的CRC患者的总体生存期。

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表5 GSE39582数据集中CRC的基因表达与临床特征之间的相关性

此外,在GSE39582中CRC患者的Cox回归分析显示,CDC6,CDC45或ORC6表达低,TNM分期,淋巴结转移以及肿瘤浸润深度是影响预后的危险因素。多变量Cox回归分析显示,低CDC6,CDC45和ORC6的表达是CRC患者RFS的独立危险因素。此外,对TCGA中CRC样本的多变量Cox回归分析表明SNHG7的表达,远处转移和TNM分期是影响CRC患者OS的独立危险因素。这些结果表明,CDC6,CDC45,ORC6以及SNHG6显著影响CRC患者的预后。

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表6 TCGA中CRC标本SNHG7的表达与临床特征之间的相关性

5 DEGs和DEL的实时PCR验证

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图7 在198个CRC和相邻粘膜样品中差异表达基因的验证

为了验证这几个基因的表达差异,我们在198对配对的CRC和癌旁样本中进行了RT-PCR验证。结果显示,4个基因均在癌组织中表达上调。随后作者探讨了CRC患者CDC6,CDC45,ORC6和SNHG7表达水平与临床病理因素的相关性。

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图8 临床病理特征与CDC6,CDC45,ORC6和SNHG7表达的关系

另外,在CRC组织中观察到lncRNA SNHG7水平与CDC6 / CDC45 / ORC6表达水平呈正相关。这表明SNHG7可能通过调节CDC6、CDC45或ORC6的表达而影响CRC的细胞周期。

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图9  SNHG7与CDC6,CDC45和ORC6的表达相关性

6 关键基因区分健康与CRC患者的诊断效能

作者进一步通过SNHG7,CDC6,CDC45和ORC6表达的ROC曲线评估了它们在CRC和良性组织之间的诊断价值。结果显示,SNHG7的ROC曲线下面积(AUC)为0.84;CDC6为0.88;CDC45为0.82;ORC6为0.85。

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图10  SNHG7,CDC6,CDC45和ORC6区分CRC与良性疾病的诊断效能

三、小结:

在本研究中,作者首先从GEO四个数据集中检测到519个常见差异表达基因,鉴定485个DELs作为诊断CRC的候选生物标志物,并进行了功能富集分析,进一步选定了四个分子作为研究对象,后续用PCR验证了在临床标本中的表达,并在最后用ROC曲线分析了CDC6、CDC45、ORC6和SNHG7的诊断作用,可作为CRC的潜在干预靶点,思路清晰。

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