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快上车!胃癌单细胞测序5+生信分析思路!

单细胞测序 管理员 200℃ 0评论

快上车!胃癌单细胞测序5+生信分析思路!插图今天和大家分享的是2020年2月份发表在Aging杂志上的一篇文章(IF=5.515)“Single-cell RNA sequencing of immune cells in gastric cancer patients”。文章中作者根据单细胞RNA测序数据GC患者中分离的T细胞异质性,确定了不同的免疫细胞亚型及其异质转录因子,并对不同细胞亚群中的不同基因进行分析,为GC中免疫细胞的靶向治疗提供了理论基础。

Single-cell RNA sequencing of immune cells in gastric cancer patients

针对胃癌患者免疫细胞的单细胞测序

一、研究背景

免疫检查点抑制剂(包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1))的抗体可用于治疗多种癌症,但这种抗体治疗的研究的局限性之一是无法表征不同细胞对检查点抑制剂的反应能力。胃癌(GC)预后相对较差,特别是对于患有肿瘤,淋巴结转移(TNM)T3和T4期的患者。单细胞RNA测序能够在单细胞水平上对高度复杂的肿瘤微环境中的细胞群体进行特异性分析,从而揭示了未表征的分子复杂性。与大量分析相比,单细胞分析可能更准确地鉴定出肿瘤中的罕见基因突变,因此可能有助于设计最佳的治疗方法以防止肿瘤再生。但是,目前没有关于单细胞测序到GC的特定应用的报道。作者主要针对CD8+ 耗竭T细胞和Treg细胞进行了多种分析为GC的免疫治疗提供理论基础。

二、研究思路

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三、结果解读

1 从主要GC样品和免疫细胞

聚类中获取scRNA-seq图谱

对从9个样品中分离出的免疫细胞进行scRNA-seq测序(组成情况:从两个健康个体采集的两个外周血样品,从三个GC患者采集的三个术前外周血样品,以及从胃癌组织中采集的两对胃癌组织和相应的相邻非肿瘤组织两名GC患者)。基于CD45分离对没有预选的细胞子集进行了分类捕获肿瘤微环境的全部光谱,并确保有足够数量的免疫细胞进行分析。按样本分离的数据结果在表格1。

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表格1.患者的样本信息

通过根据细胞的分子和功能特性对细胞进行分类,我们确定了组织中的10个细胞亚群和外周血中的9个细胞亚群。接下来,我们确定了每种免疫细胞亚型及其异源性转录因子(TFs)。图1B 显示了他们的发展轨迹(图1B)。最后确认了某些基因的表达,并分析了其与临床特征的相关性。

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图1.研究设计概述

2与正常样品相比,GC样品中

耗竭型CD8 + T细胞中的IRF8低表达

为揭示CD8 + T细胞的内在结构和潜在功能亚型,包括初始型,细胞毒性型和耗竭型CD8 + T细胞,所以分别分析了T,N和PB,HB组的基因,并绘制热图和火山图。由于共抑制受体(例如PDCD1和TIGIT)是癌症免疫疗法的靶标,因此将重点放在分析GC中耗竭型CD8 + T细胞的富集上。通路分析表明,肿瘤浸润的耗竭型CD8 + T细胞中的这些不同基因可能与细胞因子的产生有关(图2C)。在轨迹分支方面,观察到它始于GC组织中的细胞毒性CD8 + T细胞,最后以耗竭型CD8 + T细胞在血液中结束(图2E),这与肿瘤的正常进程是一致的。评估11例GC患者肿瘤中浸润的CD8 +耗竭型T细胞和CD8 + TIL中干扰素调节因子8(IRF8)转录因子的表达发现,与正常组织相比,IRF8在两种组织中均被下调(图2F)。此外,还在初诊时分析了32例GC患者的外周血单个核细胞(PBMC),以使用流式细胞仪评估CD8 + T细胞中IRF8的表达(图2G)。

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图2. 转录因子IRF8与GC中的CD8 + T细胞相关

根据癌症基因组图谱(TCGA)的GC数据,IRF8的下调与总体生存期(OS)缩短有关(图2H)。Open Targets软件显示IRF8在免疫系统的细胞中起着负调控作用(图2I)。根据外周血CD8 + T细胞中IRF8的平均水平,将GC患者分为Peri-CD8-IRF8高和Peri-CD8-IRF8低。血液CD8 + T细胞中IRF8表达低的GC患者的肿瘤晚期(表2)。这些数据表明:IRF8与GC中耗竭型CD8 + T细胞有关。

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表2. 两组患者的临床和病理特征

3 鉴定与GC中Treg功能唯一相关的基因

调节性T细胞(Tregs)参与免疫耐受。结果表明,与对照组相比,GC患者外周血中血液分离的Tregs中的KDM5D和ADRB2上调,并且KDM5D和ADRB2的高表达与不良预后相关。这表明KDM5D和ADRB2可能充当循环血液中的非侵入性标志物,以监测GC患者的预后。

在肿瘤浸润的Treg中发现与相邻的正常组织相比,GC组织中的IFIT2,CCL3,RBPJ等被上调,而IGJ,XCL1,XCL2等被下调(图3A)。通路分析表明他们富含细胞因子-细胞因子受体相互作用,PI3K-AKT和NF-kB途径。对于轨迹分支,在肿瘤环境中观察到的效应物Treg少得多,而GC组织中的初始型则更为明显。发现转录因子RBPJ在肿瘤浸润的Tregs中过表达(图3E)。使用STRING进行的互动网络分析显示,RBPJ参与了NOTCH途径(图3F)。GSEA单细胞分析结果表明RBPJ可能主要通过调节DNA修复,转移和缺氧来抑制癌症进展。为了探索可能调节RBPJ表达的潜在网络,分析可能促进或抑制RBPJ基因转录的TF,我们使用Cistrome DB Toolkit(在癌症组织中发现了前20个TFs差异表达)。发现RBPJ可能作为TF来促进GC中LAG3和GEPIA2表达:

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图3. 鉴定与GC中Treg功能唯一相关的基因

4 B细胞的基因标记和GC中的途径分析

癌组织和癌旁组织之间B细胞亚群中差异表达的基因由EIF1AY,KRT19,LCN2,RPS4Y1等组成。在PB vs HB组中,RORA,COL6A2,ETS1,FHIT等上调,而HBA2,HBA1,IGLL5,C1CB等下调。通路分析显示,B细胞亚群中上调的基因集中在TNF,NOD样和CXCR趋化因子受体结合通路中。在T对N和PB对HB分组中进行了热图分析,结果表明B细胞通过产生包括IFNG,CCL3,IL-8等在内的细胞因子发挥免疫调节功能。GC患者中CD40(一种B细胞激活受体)被下调。

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图4. B细胞的基因标记和途径分析

5 NK细胞响应GC分泌更多的

抑制性受体和更少的活化性受体

NK细胞是先天免疫的重要组成部分,由于其释放细胞因子和介导针对肿瘤细胞的溶细胞活性的能力,因此在宿主防御中起关键作用。研究中发现与相邻的正常组织相比,GC组织中IL8,G0S2,HSPA6,CXCL1等被上调,而IGJ,TFF1,NCR2等被下调。在PB vs HB组中,SCAF1,LAG3,TPM1等过表达,而IGLL5,IGJ,C1QB等过表达。通路分析表明,这些基因可能参与细胞因子与细胞因子受体的相互作用,MAPK信号传导,趋化因子信号传导和T细胞受体信号传导。与对照相比,NK细胞在GC组织中表达更多的抑制性受体,例如KIR2DL2。同样,与对照组相比,NK细胞在GC患者血液中表达的活化受体如KLRK1和CD226更少。最后,NK细胞在GC中分泌更多的细胞因子,包括CCL3和CCL4。综上所述,这些数据表明NK细胞积极参与免疫监视以预防GC。

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图5. NK细胞分泌更多的抑制受体和更少的活化受体

6 GC中不同的树突状细胞亚型及其相互作用

树突状细胞(DC)是适应性免疫反应的中心调节剂,因此对于T细胞介导的癌症免疫是必需的,列出了DC细胞亚群中差异表达的基因。途径分析表明这些基因富含细胞因子活性和免疫应答,MAPK和NF-KB途径。浆细胞样DC(pDC)被认为是I型干扰素(IFN-I)的主要生产者,可通过对肿瘤和免疫细胞的直接活性来促进抗肿瘤免疫力。

pDC选择性表达TLR7和TLR9,其最重要的功能是响应单链病毒RNA和DNA产生大量IFN-I 。我们的数据表明,pDC在GC患者中表达的TLR7比对照组中的多。此外与正常组织相比,DC细胞在GC组织中表达更多的抑制性受体,例如FTL和IL8,在GC患者血液中与对照相比,分泌的细胞因子(包括CCL4和CCL5)更少。髓样DC(mDC)是非常有效的抗原呈递细胞(APC),具有引发初始型T细胞并因此引发初级适应性免疫应答的独特能力。分子(包括TLR1,TLR2,TLR6和TLR10)在mDC中差异表达。DC亚型的复杂性及其相互作用,意味着可能有必要采取多种互补策略来根除接受DC介导的抗癌治疗的GC癌症患者。

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图6.GC中不同的DC亚型及其相互作用

7 GC中巨噬细胞的基因验证

巨噬细胞是肿瘤微环境的主要组成部分,它们根据其状态促进或抑制肿瘤发生和转移。通路分析未能鉴定出巨噬细胞亚群中差异表达的基因。在三组中列出了一些关键的炎性细胞因子,抑制性受体,血管生成因子,趋化因子,对血管生成因子,生长因子的抑制等。结果显示,与对照组相比,巨噬细胞在GC组织中表达更多的IL1RN,CXCL1和IL8,在GC血液中表达更多的CCL5,IL2RG和C10orf54。可塑性是骨髓单核细胞系细胞的标志。对巨噬细胞可塑性的分子基础的更好理解将为GC的免疫病理学和治疗干预开辟新的前景。

四、小结

作者基于流式细胞仪和单细胞RNA-seq分析了一批新确诊的GC患者的免疫细胞,通过两个角度分别分析了不同细胞亚群中的不同基因。与对照组相比,IRF8转录因子在GC组织的CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中被下调,而IR患者中IRF8水平较低的GC患者血液CD8 +T细胞倾向于处于更晚期的疾病阶段。这些发现为GC靶向免疫治疗提供了理论基础,可作为研究免疫细胞基本特征并潜在指导免疫治疗。

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